rna干扰沉默ezh2基因对人膀胱癌ej细胞增殖的影响

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1、RNA干扰沉默EZH2基因对人膀胱癌EJ细胞增殖的影响【摘要】目的：研究RNA干扰沉默EZH2基因对人膀胱癌EJ细胞周期和增殖的影响.方法：体外构建EZH2基因的shRNA的表达载体，Lipofectamin2000介导转染膀胱癌EJ细胞，采用RTPCR和TT法检测shRNA对细胞增殖的作用；应用PI单染流式细胞术分析对细胞周期的改变.结果：EZH2基因的shRNA表达载体有效下调EZH2基因的表达（P<0.05）.与对照组比较，细胞增殖明显抑制（P<0.05）；同时引起细胞G1期阻滞，RNA干扰后,G1期细

2、胞增加［(84.0±8.7)%vs(52.0±6.8)%,P<0.05］，S期细胞减少［（11.0±1.1）%vs（43.0±4.9）%,P<0.05］.结论：EZH2基因有望成为应用RNAi技术探索膀胱癌基因治疗的潜在靶基因.【关键词】膀胱肿瘤EZH2基因RNA干扰细胞增殖细胞周期　　0引言　　EZH2基因(enhancerofzesthomolog2,EZH2)是多梳基因家族（polybgroup，PcG）的主要成员，与果蝇zeste基因增强子是同源基因.在胚胎发育早期普遍存在，其高表达可促进细胞增殖，并参

3、与肿瘤的发生发展［1］.有研究［2］显示，EZH2基因在膀胱癌组织表达增加，与浸润转移密切相关，但作用机制还不明确.本研究以EZH2基因为靶点,设计构建其短发夹状RNA的表达载体并转染膀胱癌EJ细胞，观察EZH2基因对膀胱癌细胞增殖和细胞周期的影响并探讨其作用机制，为膀胱癌基因治疗提供实验基础.　　1材料和方法　　1.1材料人膀胱癌EJ细胞由天津泌尿外科研究所保存.Lipofectamine2000，RNA提取纯化试剂TRIzol（美国Invitrogen公司）；RTPCR试剂盒，质粒DNA提取试剂盒（北京博大泰克生物制

4、品公司）；抗人EZH2多克隆抗体，SP试剂盒，DAB显色试剂盒（深圳晶美生物工程有限公司）.　　1.2方法　　1.2.1EZH2基因shRNA表达载体的构建根据　　图2EZH2mRNA在实验各组表达（略）　　1：RNA干扰组;2:阴性质粒组;3:对照组.　　图3EZH2蛋白在实验各组表达（略）　　2.4MTT法比较EJ细胞增殖活性细胞增殖曲线显示，与对照组比较，RNA干扰组的EJ细胞其增殖速度明显降低，转染后24，48，72，96和120h，细胞生长抑制率分别为43.9%，59.1%，49%，45.5%和45.2%，以转

5、染后48h最高，与对照组比较差异均有统计学意义（P<0.05），而阴性质粒组细胞生长变化与对照组比较无明显差异（P>0.05，图4）.　　图4MTT方法检测细胞增殖情况（略）　　2.5流式细胞仪检测RNA干扰组G1期细胞为（84.0±8.7）%，S期细胞为（11.0±1.1）%，而对照组G1期细胞为（52.0±6.8）%，S期细胞为（43.0±4.9）%，两者相比较差异均有统计学意义（P<0.05，图5）.　　3讨论　　肿瘤细胞的异常增殖与肿瘤的侵袭和转移密切相关，这一病理过程涉及许多基因的参与.EZH2

6、基因是新发现的癌基因，在胚胎发育早期普遍存在，是维持细胞增殖所必需的，研究发现EZH2基因高表达的肿瘤组织增殖能力加强并与肿瘤侵袭转移密切相关［4-5］，因此，作为一个新的分子标志物引起研究者的广泛关注.本研究我们发现，靶向EZH2基因shRNA转染膀胱癌EJ细胞后，细胞的增殖能力明显下降，提示EZH2基因可能是膀胱癌基因治疗的一个新靶点.EZH2是一种转录抑制因子，其编码蛋白含有高度保守的SET结构域，该结构域具有甲基转移酶的活性，通过甲基化作用抑制下游基因的表达，其中大多为抑癌基因，结果导致在肿瘤侵袭转移过程中促进肿瘤

7、转移和抑制肿瘤转移基因间的相互作用倾向于前者，促进了肿瘤的增殖和转移［6-7］.　　A：RNA干扰组；B：对照组.　　图5RNA干扰组和对照组细胞周期分布（略）　　细胞周期调控异常是恶性肿瘤增殖异常的主要原因，肿瘤是多基因疾病，许多基因直接或间接参与细胞周期调控，这些基因的突变或表达异常可以引起细胞周期的失控，使肿瘤细胞获得以细胞增殖为主的失控性生长特征［8］.有研究证实EZH2基因高表达可以抑制一些细胞周期相关基因的表达，促进细胞进入S期和G2M期转换［3］.我们的研究也证实靶向EZH2基因shRNA表达载体转染膀胱癌

8、EJ细胞后，进入G1期的EJ细胞明显增多，进入S期的细胞明显减少，EJ细胞出现G1期阻滞.这表明通过RNA干扰下调EZH2基因表达后，抑制了肿瘤细胞恶性增殖信号转导，阻滞细胞周期进展，使细胞增殖能力下降.MTT检测显示在转染后48h细胞增殖抑制率最高，我们推测一方面EZH2的表达是否有细胞周期依赖性，另