RNA干扰沉默EZH2基因对人膀胱癌EJ细胞增殖的影响.doc

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1、RNA干扰沉默EZH2基因对人膀胱癌EJ细胞增殖的影响【摘要】目的：研究RNA干扰沉默EZH2基因对人膀胱癌EJ细胞周期和增殖的影响.方法：体外构建EZH2基因的shRNA的表达载体，Lipofectamin2000介导转染膀胱癌EJ细胞，采用RTPCR和WesternBlot方法检测特异性shRNA对EZH2基因沉默效果，转染后采用MTT法检测shRNA对细胞增殖的作用；应用PI单染流式细胞术分析对细胞周期的改变.结果：EZH2基因的shRNA表达载体有效下调EZH2基因的表达（P<0.05）.与对照组比较，细胞增殖明显抑制（P<0.05）；同时引起细胞G1

2、期阻滞，RNA干扰后,G1期细胞增加［(84.0±8.7)%vs(52.0±6.8)%,P<0.05］，S期细胞减少［（11.0±1.1）%vs（43.0±4.9）%,P<0.05］.结论：EZH2基因有望成为应用RNAi技术探索膀胱癌基因治疗的潜在靶基因.【关键词】膀胱肿瘤EZH2基因RNA干扰细胞增殖细胞周期　　0引言　　EZH2基因(enhancerofzesthomolog2,EZH2)是多梳基因家族（polycombgroup，PcG）的主要成员，与果蝇zeste基因增强子是同源基因.在胚胎发育早期普遍存在，其高表达可促进细胞增殖，并参与肿瘤的发生发展

3、［1］.有研究［2］显示，EZH2基因在膀胱癌组织表达增加，与浸润转移密切相关，但作用机制还不明确.本研究以EZH2基因为靶点,设计构建其短发夹状RNA的表达载体并转染膀胱癌EJ细胞，观察EZH2基因对膀胱癌细胞增殖和细胞周期的影响并探讨其作用机制，为膀胱癌基因治疗提供实验基础.　　1材料和方法　　1.1材料人膀胱癌EJ细胞由天津泌尿外科研究所保存.Lipofectamine2000，RNA提取纯化试剂TRIzol（美国Invitrogen公司）；RTPCR试剂盒，质粒DNA提取试剂盒（北京博大泰克生物制品公司）；抗人EZH2多克隆抗体，SP试剂盒，DAB显色试剂盒（深

4、圳晶美生物工程有限公司）.　　1.2方法　　1.2.1EZH2基因shRNA表达载体的构建根据文献［3］的方法，选择EZH2mRNA的461~481bp之间的核苷酸序列AAGACTCTGAATGCAGTTGCT为RNA干扰的靶序列，体外合成两端带有BamHⅠ和HindⅢ粘端酶切位点，内含5′AAGACTCTGAATGCAGTTGCTTTCAAGAGAAGCAACTGCATTCAGAGTCTT3′发夹状序列的双链DNA,将合成的片段接入pRNAT载体,转染DH5α大肠杆菌，筛选、扩增，经测序证实构建成功，称之为EZH2shRNA；同时构建阴性表达质粒,称之为EZH2s

5、crambled.5　　1.2.2重组质粒转染复苏的膀胱癌EJ细胞置事先加含100mL/L胎牛血清的RPMI1640培养基的100mm培养皿中，37℃，50mL/LCO2孵箱内培养，常规更换培养液、传代.实验用细胞均使之处于状态良好的对数生长期.转染前1d按试验要求将所需密度的细胞接种6孔培养板，待细胞达到所需融合率时在无血清的DMEM环境中转染，操作步骤按Lipofectamin2000说明书进行.实验分为：转染EZH2shRNA质粒为RNA干扰组；转染EZH2scrambled为阴性质粒组；未转染的EJ细胞为对照组.　　1.2.3RTPCR检测EJ细胞EZH2基因

6、mRNA表达转染后48h后，收集各实验组EJ细胞约1×107，提取细胞总RNA.取5μg总RNA，加入1μL由16个脱氧胸苷酸碱基组成的寡核苷酸Oligo（Dt）16，按说明书操作合成cDNA的第一链，然后进行PCR反应.GAPDH为内参照.引物的序列为EZH2（289bp）:上游：5′GTGGAGAGATTATTTCTCAAGATG3′，下游：5′CCGACATACTTCAGGGCATCAGCC3′;GAPDH引物(492bp):上游:5′TGAAGGTCGGTGTGAACGGATTTGG3′，下游：5′CATGTAGGCCATGAGGTCCACCAC3′

7、,反应条件为：95℃预变性5min，94℃变性50s，52℃退火50s，72℃延伸1min.各取10μL反应产物，12g/L琼脂糖凝胶电泳，ImageMasterTotalLab软件进行条带分析，以EZH2与GAPDH条带的积分吸光度比值表示EZH2mRNA的表达变化.　　1.2.4WesternBlot检测EJ细胞EZH2基因蛋白表达抗体为1∶1000稀释的EZH2抗兔人多克隆抗体，二抗为1∶200稀释的生物素标记的羊抗兔多克隆抗体，DAB显色.SDSPAGE电泳、转膜采用常规方法，βactin作为内参照.检