RNA干扰沉默EZH2基因对人膀胱癌EJ细胞增殖的影响.doc

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1、RNA干扰沉默EZH2基因对人膀胱癌EJ细胞增殖的影响【摘要】目的:研究RNA干扰沉默EZH2基因对人膀胱癌EJ细胞周期和增殖的影响.方法:体外构建EZH2基因的shRNA的表达载体,Lipofectamin2000介导转染膀胱癌EJ细胞,采用RTPCR和WesternBlot方法检测特异性shRNA对EZH2基因沉默效果,转染后采用MTT法检测shRNA对细胞增殖的作用;应用PI单染流式细胞术分析对细胞周期的改变.结果:EZH2基因的shRNA表达载体有效下调EZH2基因的表达(P<0.05).与对照组比较,细胞增殖明显抑制(P<0.05);同时引起细胞G1

2、期阻滞,RNA干扰后,G1期细胞增加[(84.0±8.7)%vs(52.0±6.8)%,P<0.05],S期细胞减少[(11.0±1.1)%vs(43.0±4.9)%,P<0.05].结论:EZH2基因有望成为应用RNAi技术探索膀胱癌基因治疗的潜在靶基因.【关键词】膀胱肿瘤EZH2基因RNA干扰细胞增殖细胞周期  0引言  EZH2基因(enhancerofzesthomolog2,EZH2)是多梳基因家族(polycombgroup,PcG)的主要成员,与果蝇zeste基因增强子是同源基因.在胚胎发育早期普遍存在,其高表达可促进细胞增殖,并参与肿瘤的发生发展

3、[1].有研究[2]显示,EZH2基因在膀胱癌组织表达增加,与浸润转移密切相关,但作用机制还不明确.本研究以EZH2基因为靶点,设计构建其短发夹状RNA的表达载体并转染膀胱癌EJ细胞,观察EZH2基因对膀胱癌细胞增殖和细胞周期的影响并探讨其作用机制,为膀胱癌基因治疗提供实验基础.  1材料和方法  1.1材料人膀胱癌EJ细胞由天津泌尿外科研究所保存.Lipofectamine2000,RNA提取纯化试剂TRIzol(美国Invitrogen公司);RTPCR试剂盒,质粒DNA提取试剂盒(北京博大泰克生物制品公司);抗人EZH2多克隆抗体,SP试剂盒,DAB显色试剂盒(深

4、圳晶美生物工程有限公司).  1.2方法  1.2.1EZH2基因shRNA表达载体的构建根据文献[3]的方法,选择EZH2mRNA的461~481bp之间的核苷酸序列AAGACTCTGAATGCAGTTGCT为RNA干扰的靶序列,体外合成两端带有BamHⅠ和HindⅢ粘端酶切位点,内含5′AAGACTCTGAATGCAGTTGCTTTCAAGAGAAGCAACTGCATTCAGAGTCTT3′发夹状序列的双链DNA,将合成的片段接入pRNAT载体,转染DH5α大肠杆菌,筛选、扩增,经测序证实构建成功,称之为EZH2shRNA;同时构建阴性表达质粒,称之为EZH2s

5、crambled.5  1.2.2重组质粒转染复苏的膀胱癌EJ细胞置事先加含100mL/L胎牛血清的RPMI1640培养基的100mm培养皿中,37℃,50mL/LCO2孵箱内培养,常规更换培养液、传代.实验用细胞均使之处于状态良好的对数生长期.转染前1d按试验要求将所需密度的细胞接种6孔培养板,待细胞达到所需融合率时在无血清的DMEM环境中转染,操作步骤按Lipofectamin2000说明书进行.实验分为:转染EZH2shRNA质粒为RNA干扰组;转染EZH2scrambled为阴性质粒组;未转染的EJ细胞为对照组.  1.2.3RTPCR检测EJ细胞EZH2基因

6、mRNA表达转染后48h后,收集各实验组EJ细胞约1×107,提取细胞总RNA.取5μg总RNA,加入1μL由16个脱氧胸苷酸碱基组成的寡核苷酸Oligo(Dt)16,按说明书操作合成cDNA的第一链,然后进行PCR反应.GAPDH为内参照.引物的序列为EZH2(289bp):上游:5′GTGGAGAGATTATTTCTCAAGATG3′,下游:5′CCGACATACTTCAGGGCATCAGCC3′;GAPDH引物(492bp):上游:5′TGAAGGTCGGTGTGAACGGATTTGG3′,下游:5′CATGTAGGCCATGAGGTCCACCAC3′

7、,反应条件为:95℃预变性5min,94℃变性50s,52℃退火50s,72℃延伸1min.各取10μL反应产物,12g/L琼脂糖凝胶电泳,ImageMasterTotalLab软件进行条带分析,以EZH2与GAPDH条带的积分吸光度比值表示EZH2mRNA的表达变化.  1.2.4WesternBlot检测EJ细胞EZH2基因蛋白表达抗体为1∶1000稀释的EZH2抗兔人多克隆抗体,二抗为1∶200稀释的生物素标记的羊抗兔多克隆抗体,DAB显色.SDSPAGE电泳、转膜采用常规方法,βactin作为内参照.检

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