胶质细胞参与吗啡耐受的形成

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1、胶质细胞参与吗啡耐受的形成【摘要】目的观察长期吗啡治疗引起胶质细胞的应答。方法采用吗啡鞘内注射和氟代柠檬酸鞘内给药，免疫组织化学方法检测星形胶质细胞的特殊标记物GFAP。结果通过星形胶质细胞的特殊标记物GFAP在免疫组织化学中进行检测，连续9天，每日1次吗啡全身给药（50mg/kg,i.p.）引起脊髓、后部扣带回皮质和海马的GFAP免疫染色密度的明显增加,而在丘脑没有变化。这种增加主要是星形胶质细胞的肥大而不是增殖或者移行。吗啡鞘内注射（20μg/2μl，i.t.）和氟代柠檬酸（1nmol/μl,

2、i.t.）——星形胶质细胞特异可逆性抑制剂，同时鞘内给药，通过行为学测试，吗啡脊髓止痛耐受只是部分而不是明显减弱，脊髓GFAP免疫染色密度增加也是部分被阻滞。结论目前研究为在体吗啡耐受形成中胶质细胞的作用提供了第一手证据。【关键词】氟代柠檬酸胶质细胞胶质细胞酸性蛋白吗啡大鼠耐受［Abstract］GlialresponsetochronicmorphinetreatmentinedbyimmunohistochemistryofglialfibrillaryacidicprotEin（GFAP）,

3、aspecificmarkerforastroglialcells.Systemicadministrationofmorphine（50mg/kg,i.p.）onceadayfor9consecutivedaysledtosignificantincreaseinGFAPimmunostainingdensityinthespinalcord,posteriorcingulatecortexandhippocampusbutnotinthethalamus.Thisincreasearilyto

4、hypertrophyofastroglialcellsratherthanthEIrproliferationormigration.DA受体和NO在阿片耐受的参与［1］，没有提到在这个过程中胶质细胞的作用。我们把胶质细胞作为研究对象是因为该细胞能释放许多介导吗啡耐受的重要物质，包括NO和环氧合酶产物［2］，假定胶质细胞触发细胞内级联的广泛作用引起中枢神经系统的可塑性改变，阿片耐受是这种可塑性的另一实例。胶质细胞参与吗啡耐受可能的研究：（1）和疼痛过程紧密相关的脊髓和后扣带回皮质；（2）参与学习

5、和记忆的海马。目前研究设计：（1）星形胶质细胞的特异性标记物GFAP在耐受形成中是否发生变化？（2）星形胶质细胞特异性代谢抑制剂氟代柠檬酸是否改变吗啡耐受的形成？1材料与方法1.1动物与给药SD雄性大鼠饲养在单个的塑料笼子内，温度22℃，给予充足的食物和水，间隔12h后给予12h光照。所有实验遵照卫生部的标准。给予硫酸吗啡［50mg/（kg·d），i.p.，Sigma,St.Louis,MO］连续9天给药，同时进行行为学测试。在苯巴比妥钠麻醉下置入聚乙烯导管（PE10）到大鼠的腰部脊髓。恢复4天后

6、，鞘内给予吗啡（20μg/2μl）连续5天，每天一次诱导脊髓耐受。第6天行吗啡激发试验（5μg/2μl）测试吗啡镇痛效应。氟代柠檬酸（Sigma）给予1nmol/μl（i.t.）一个剂量。药物用10μl生理盐水稀释。吗啡的阴性对照组用生理盐水和氟代柠檬酸、溶酶。1.2行为学测试吗啡的镇痛效应由常规的缩足试验进行评估［3］。将来自于灯泡投射的热辐射光线直接照在左后爪趾内侧皮肤。数字计时器自动读取开始热刺激到缩足的间隔时间即缩爪潜伏期（PPE）来表示。（给药后潜伏期-给药前潜伏期）（10-给药前潜伏期

7、）×100（1）1.3免疫组织化学大鼠用生理盐水和4％多聚甲醛灌注，取L4~5脊髓和脑，后固定1h，30％的蔗糖液中冷冻过夜。冰冻切片，厚度30μm。用0.3%H2O2内生性过氧化物酶，再用含有5%标准羊血清（NGS）和0.2%TritonX-100的0.01MPBS液处理，在PBS液中浸泡3次后，滴加小鼠抗GFAP抗体（1∶200,Sigma），在4℃孵育60h。用PBS液冲洗，异硫氰酸荧光素（FITC）（1∶150,Sigma），4℃孵育过夜。切片做初步定量化描述随机抽取切片用高分辨率的数码相

8、机在显微镜上拍照，免疫染色用图像分析软件（SigmaScan,JandelScientificInc,SanRafael,CA）定量。定量测量法指“反应等级”，由在不同群的免疫标记密度的比率来确定。这种比率法补偿了切片间染色的差异。1.4统计学方法所有数据采用均数±标准差（±s）表示，组内比较采用配对t检验，组间比较采用单因素方差分析，采用SPSS11.5软件进行处理，P＜0.05认为有统计学意义。2结果2.1全身性吗啡耐受大鼠GFAP免疫反应性全身吗啡给药［50mg/（kg·d）