慢性吗啡耐受大鼠脑皮质血管内皮细胞p糖蛋白表达的研究

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1、慢性吗啡耐受大鼠脑皮质血管内皮细胞P糖蛋白表达的研究广州医学院附属广州市第一人民医院麻醉科（510180）王作者单位：广州医学院附属广州市第一人民医院麻醉科（510180）责任作者：佘守章佘守章许学兵赵昭叶飞王喜连[摘要]目的：通过观察大鼠慢性吗啡耐受过程中大脑皮质毛细血管内皮细胞P糖蛋白的变化，探讨P糖蛋白参与吗啡耐受的可能机制。方法：雄性SD大鼠，体重250～280g，随机分为三组（n=6）：A组（生理盐水组）、B组（慢性吗啡耐受模型组）和C组（空白组）。全身慢性吗啡耐受水平的大鼠模型的建立采用连续9

2、天，每天两次（8AM和6PM）皮下注射吗啡10mg/kg的方法。A组皮下注射等量容积的生理盐水，C组则不予任何处理。用热辐射甩尾法进行疼痛学行为测试来测定大鼠出现甩尾反应的潜伏期（TFL阈值），以确定吗啡耐受的形成，数据表达为最大镇痛百分率（MPE％）。取大鼠大脑灌注固定后行石蜡连续横切片，片厚为2μm行免疫组化染色，观察大脑皮质毛细血管内皮细胞P糖蛋白的表达情况。结果：在B组中大脑皮质毛细血管内皮细胞P糖蛋白大量表达，呈强阳性；而生理盐水组则呈现弱阳性,空白组则呈现阴性。结论：产生慢性吗啡耐受后，大鼠大

3、脑皮质毛细血管内皮细胞P糖蛋白大量表达，而对照组显示不明显，本研究初步表明P糖蛋白参与吗啡耐受的发生机制。[关键词]吗啡耐受；脑毛细血管内皮细胞；P糖蛋白伴随阿片类药物应用产生的阿片耐受不仅是一个医学问题，更是一个日趋严重的社会问题。临床上吗啡是慢性疼痛治疗的最基本药物，但长时间应用后会诱导产生吗啡耐受。吗啡耐受严重影响慢性疼痛的治疗效果和患者生活质量。学者们认为阿片受体丢失、胞吞内化、失敏感化、G蛋白磷酸化或与arrestin结合，以及NMDA受体或NO/NOS系统发生改变等是吗啡耐受的原因。近年来有文

4、献表明真正作用于脑内阿片受体的吗啡浓度降低也是产生吗啡耐受的机制之一，主要是由于吗啡长期作用机体后某些组织器官P糖蛋白表达增加引起的。本文拟运用免疫组化的方法来研究慢性吗啡耐受形成后大鼠大脑血脑屏障毛细血管内皮细胞膜表面P糖蛋白的变化，探讨P糖蛋白参与吗啡耐受的可能机制。材料与方法实验动物与分组雄性Sprague-Dawley大鼠18只，体重250～280g，由广东省实验医学动物中心提供，在安静、白天与黑夜12小时循环光照、自由取食与饮水环境中适应一周后开始实验。随机分为3组，每组6只。A组（生理盐水组）

5、：皮下注射生理盐水10ml·kg-1；B组（慢性吗啡耐受模型组）：皮下注射吗啡10mg·kg-1；C组（空白组）：不予任何处理。各组每天重复用药两次，时间分别是8：00和18：00，连续9天。隔天第一次给药后1小时，用热辐射甩尾法进行疼痛学行为测试来测定大鼠出现甩尾反应的潜伏期（TFL阈值）做为疼痛指标。主要试剂与仪器盐酸吗啡注射液（沈阳第一制药厂，10mg/ml,批号060114），鼠抗P糖蛋白单克隆抗体（DarkoLtd.）,KONTRONIBAS2.0全自动图像分析系统（德国）和热辐射甩尾测痛仪（美

6、国ISI公司）。慢性吗啡耐受模型的制备参照项红兵等[1]报道的方法，以盐酸吗啡10mg·kg-1对大鼠进行皮下注射，每天重复用药两次，连续9天。热辐射甩尾法痛阈行为学测定将大鼠置于固定器内10min，安静后将鼠尾平放在热辐射甩尾测痛仪的凹槽中，开启50W卤素灯作为热辐射光源，照射鼠尾中后1/3处，记录从热源启动到大鼠甩尾的时间作为甩尾反应的潜伏期（TFL阈值）。每只大鼠测定3次，每次间隔10min，以平均值作为痛阈，以15s作为终止时间以防组织损伤。数据表达为最大镇痛百分率（MPE％），其计算公式为：MP

7、E%=[(给药后痛阈-给药前痛阈)/（15-给药前痛阈）]×100％组织制备和免疫组化染色各组于第九天测完痛阈后用10％水合氯醛麻醉（3.5ml/kg,i.p）将大鼠深麻醉，快速开胸至升主动脉，先用0.9％生理盐水开始快速灌注，待右心耳流出液变为淡红色，再迅速改用4％多聚甲醛灌注固定。取大鼠大脑（去除脑干和小脑部分），在上述多聚甲醛固定液中后固定4～6小时后常规制成石蜡块，将石蜡组织块行连续冠状切片，片厚为2μm。每只动物取4张切片行免疫组化染色。实验采用KONTRONIBAS2.0全自动图像分析系统（德

8、国），测定P糖蛋白免疫反应阳性染色强弱来反映大鼠吗啡耐受的程度。统计学处理实验结果数据以均数±标准差（）表示。用SPSS11.0软件包行单因素方差分析，P＜0.05为差异有统计学意义。结果吗啡耐受过程中痛反应的变化A组皮下注射生理盐水和C组不予任何处理的大鼠在各时间点测定的MPE％几乎为0；B组皮下注射吗啡10mg·kg-1的大鼠在第三天的MPE％为（75.1±8.5）％，第五天和第七天分别下降至（48.6±5.7）％和（38