木瓜中多糖的提取、分离与鉴定

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1、木瓜中多糖的提取、分离与鉴定　　摘要：采取索氏抽提法、水提醇沉法、乙醇回流提取法、复合提取法从木瓜中提取多糖，经过分离纯化后，进行IR鉴定。为木瓜多糖的工业化生产提供了一定的理论依据。　　关键词：木瓜；多糖；提取；分离；鉴定　　　　0前言　　　　多糖（polysacharides，PS），又称多聚糖，是一种具有广泛生物活性的大分子。从各种中草药和其他植物中都可以提取分离出多糖，我国近年来对植物多糖，特别是具有中国特色的中草药多糖的药物活性已有广泛报道。　　木瓜原名番木瓜，始载于《名医别录》，属蔷薇科木瓜属植物

2、，是我国特有果木之一，主要生长在亚热带温暖湿润的山区地带，是一种药食同源的植物，性温味酸。现代医学证明：木瓜果实中含有丰富的糖分、番木瓜碱、木瓜蛋白酶，并含有17种以上的氨基酸及多种微量元素。目前已有大量木瓜产品上市，如木瓜饮料、木瓜醋、木瓜奶、木瓜酒、木瓜干片、木瓜脯等，深受人们的喜爱。　　湖北建始县盛产木瓜，但是创收的途径主要是通过销售鲜木瓜或干木瓜，其他相关产品的开发并不多见。从木瓜中提取和分离鉴定具有保健和药理活性的功能性成分，对于提高木瓜的经济价值，解决目前农民木瓜丰产不丰收、大量木瓜急待加工开发的

3、问题具有积极的意义。　　本实验对木瓜中多糖进行研究，拟对其提取工艺进行优化，并对粗多糖进行分离纯化鉴定组成和结构进行初步表征，为进一步提高木瓜的附加值提供试验依据。　　　　1材料与方法　　　　1.1材料　　（1）原料：湖北省建始县干木瓜片，粉碎机粉碎　　（2）仪器：TDL-5-A台式离心机，UV-7504紫外-可见分光光度计，SHZ-Ⅲ型循环水真空泵，紫外扫描仪，付立叶变换红外光谱仪，Prostar高效液相色谱仪等。　　（3）试剂：石油醚（沸程60-90℃），丙酮，乙醇（95%），戊醇，三氯甲烷，氯化钠，磷酸

4、二氢钠，磷酸氢二钠，硫酸，盐酸，苯酚，葡萄糖，乙醚，三氟三氯乙烷，三氯醋酸，碘液，硫酸铜，酒石酸钾钠，D-半乳糖，溴化钾，碳酸钡。　　　　1．2方法　　（1）多糖的测定：用苯酚-硫酸法对多糖测定。　　（2）多糖的提取：①不同提取多糖方法的比较。分别用索氏抽提法，水提醇沉法，乙醇回流提取法，复合提取法提取木瓜中的多糖，并比较多糖得率，选择较好的水提醇沉法进行优化处理。　　②水提醇沉法提取多糖工艺的优化　　单因素试验　　a温度对提取率的影响：加水量为30ml，水提时间为30分钟，分别在75℃、80℃、85℃、90

5、℃、95℃的水浴条件下，提取多糖，用苯酚-硫酸法测定其含量，　　b加水量对提取率的影响：水浴温度为90℃，水提时间为30分钟的条件下，改变加水量，提取多糖，并采用苯酚-硫酸法进行测定，　　c水提时间对提取率的影响：水浴温度为90℃，加水量为40ml的条件下，不同的水提时间对多糖得率的影响，　　正交试验　　根据单因素实验的结果，选取合适的水平，对其进行优化处理。　　　　（3）多糖的分离、纯化。　　①蛋白质的去除：分别用Sevage法，三氟三氯乙烷法，三氯醋酸法去除样品中的蛋白质。　　②低聚糖等小分子杂质的去除：

6、通过逆向流水透析除去低聚糖等小分子杂质。　　③多糖的柱层析纯化：采用DEAE-52纤维素离子交换柱柱层析方法进行。　　依次用0.5mol／L的NaOH、HCl和蒸馏水处理填柱材料至中性，反复处理三次后用蒸馏水洗至中性，抽气装柱。用pH=7.6PBS溶液平衡48小时。称取粗多糖1.0g，溶于少量蒸馏水中，离心除去不溶物，上清液过柱。用0.1-2.0mol／L的NaCl-PBS溶液梯度洗脱，控制流速为1ml／min，采用部分收集器按5ml／tub收集。以苯酚-硫酸法测吸光值（490nm）作洗脱曲线，根据吸光值将同

7、一组分合并。　　（4）多糖的鉴定。　　①淀粉的碘反应：将纯化后的得到的多糖配制成5%的溶液，滴加碘液0.2ml，水浴加热，观察颜色是否有变化，同时做淀粉的对比试验。　　②溶解性：称取纯化后的多糖0.5g，加入3ml的水，常温下搅拌，观察其溶解性。　　③还原糖的测定：取0.1mg／ml的多糖溶液50ml于试管中，在80℃的恒温水浴锅中保温30分钟，吸取6ml，加入4ml的斐林试剂（等体积的斐林试剂A液和斐林试剂B液混合），于590nm处比色。　　④蛋白质的测定：将纯化得到的多糖在190-400nm处进行UV扫描

8、，观察在250-280nm处没有吸收峰，判断是否有核酸和蛋白质的存在。　　⑤IR鉴定多糖中糖苷键的类型：将多糖与溴化钾烘干后，称取多糖2mg与100mg的溴化钾研磨，压片，置于红外图谱分析仪中作红外分析。　　⑥HPLC鉴定多糖中单糖的组成：用高效液相色谱法对木瓜多糖的单糖组成进行定性鉴定。　　样品的处理：称取纯化后的多糖10.0mg，加1mol／L的硫酸2ml，充N2后于100℃水浴加热5h，用Ba