反义寡核苷酸转染a375细胞实验条件的优化

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1、反义寡核苷酸转染A375细胞实验条件的优化【摘要】　　目的研究不同的转染条件下，Survivin反义寡核苷酸(ASODN)对体外培养的人恶性黑色素瘤细胞A375生长的影响。方法通过对ASODN进行硫代修饰、脂质体运转及培养条件的改变，用倒置显微镜、台盼蓝计数观察SurvivinASODN对A375细胞增殖的抑制作用。结果硫代修饰ASODN经脂质体包裹对细胞生长抑制作用明显强于未经脂质体包裹组(P<0.01)；②细胞培养6h贴壁后进行转染对细胞的生长抑制率明显高于24h后进行转染(P<0.05)；③转染期间(4h)无血清存在组与相应对照组

2、比较差异有显著性意义(P<0.01)；④ASODN转染后12-72h，对细胞的抑制效应逐渐升高，72h达顶峰，之后开始回落；⑤与混杂组(SODN)及错配组(MODN)相比，反义组在各个浓度对细胞生长抑制作用最明显，各浓度组比较差异有统计学意义(P<0.05)。结论许多因素影响ASODN的转运，不同的实验应选择不同的实验优化条件。【关键词】survivin；恶性黑色素瘤；反义寡核苷酸；脂质体；细胞培养　　Experimentalstudiesofoptimizedtransfectionconditiononhuman　malignant

3、melanomacellbysurvivinantisenseoligonucleotide　　ABSTRACT:ObjectiveToobserveeffectsofsurvivinantisenseoligonucleotideonproliferationofhumanmalignantmelanomacellinvitroindifferenttransfectioncondition.MethodsByusingtrypanblueexclusionmethod,thisstudyscreenedoptimizedtransfection

4、conditionthatinhibitedA375cellviability.Results①Bythephosphorothiotemodificationandtheliposomeencapsulation,therepresentgroup,theserumfreegrouphadgreatereffectonthecellgroentshouldselectdifferentoptimaltransfectioncondition.　　KEYarker相比较，可见A375细胞中一分子质量约为16.5ku的特异条带出现(图1)。　

5、　2.2Oligofectamine对ASODN的影响　　2.2.1不同浓度Oligofectamine对细胞生长的影响脂质体以1mL/L的10μmol/Loligo终浓度作用于A375细胞72h，对细胞存活无明显影响，最高抑制率仅3.34%。各组与对照组相比，差别无统计学意义(P>0.05，表1)。　　图1A375细胞中survivin蛋白的表达（略）　　Fig.1TheexpressionofsurvivinprotEininA375cell　　A:16.5kusurvivinband;B:protEInmarker　　表1Oligofe

6、ctamine对A375细胞生长的影响（略）　　Table1TheeffectofoligofectamineonA375cellproliferation　　2.2.2Oligofectamine介导ASODN转染对细胞生长的影响不同浓度ASODN经脂质体携带转染A375细胞，转染后72h细胞计数。在实验设置各浓度点上，ASODNL对细胞生长抑制作用均高于ASODN组，在10、20μmol/L两个浓度时段上两组之间差异有统计学意义(P<0.05，表2)。　　表2脂质体介导转染对ASODN作用的影响（略）　　Table2Theeffecto

7、fASODNonA375cellproliferationbyoligofectamineencapsulation　　Controlgroupcellcount:68.8±5.7；*P<0.05vs.ASODNgroup　　2.3Oligofectamine转染条件优化各实验组分别在转染后72h，计数细胞并与相同条件下对照组相比计算细胞生长抑制率。细胞培养24h后转染和培养6h后转染，转染期间(4h)无血清存在组与相应组比较差异均有显著性意义(P<0.05)。无血清阻断实验条件下，细胞培养6h贴壁后进行转染对细胞的生长抑制率明显高于

8、24h后进行转染，两组间差异有统计学意义(P<0.05，表3)。因此，选择细胞培养6h贴壁后进行转染及转染期间不存在