反义寡核苷酸抑制人恶性黑素瘤a375细胞survivin mrna及其蛋白的表达

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1、反义寡核苷酸抑制人恶性黑素瘤A375细胞survivinmRNA及其蛋白的表达作者：梁秦龙，王梅，王冰，赵继元【摘要】　　目的研究survivin反义寡核苷酸(ASODN)对人恶性黑素瘤A375细胞survivinmRNA及蛋白表达的影响。方法人工合成survivinASODN，脂质体介导转染人恶性黑素瘤细胞株A375，采用原位杂交、免疫组化SP法检测survivinmRNA及其蛋白表达的变化。结果转染24h后，ASODN组A375细胞survivinmRNA表达较对照组显著下调(P<0.01)；转染48h后，与对照组相比，ASODN组细胞的survivin蛋白水平显著下降(P<

2、;0.01)。结论SurvivinASODN可下调A375细胞survivinmRNA的表达和survivin蛋白水平。【关键词】survivin恶性黑色素瘤反义寡核苷酸　　ABSTRACT:ObjectiveTostudytheeffectsofsurvivinantisenseoligodexynucleotide(ASODN)ontheexpressionofsurvivinmRNAanditsproteininhumanmalignantmelanomacelllineA375.MethodsSurvivinASODNwassynthesizedandtransfectedinto

3、melanomacelllineA375bytheliposome-encapsulation.SurvivinmRNAandproteinweredetectedbyinsituhybridizationandimmunohistochemistry,respectively.9ResultsAt24hafterthetransfection,theexpressionofsurvivinmRNAwassignificantlylowerintheASODNgroupthaninthecontrolgroup(P<0.01).Theexpressionofsurvivinprote

4、inwasalsosignificantlydecreasedintheASODNgroupthaninthecontrolgroupat48haftertransfection(P<0.01).ConclusionSurvivinASODNcandown-regulatetheexpressionofsurvivinmRNAanditsproteininA375cells.　　KEYWORDS:survivin;malignantmelanoma;antisenseoligonucleotide　　Survivin是新近发现的一种结构独特的哺乳类凋亡抑制蛋白(inhibitiona

5、poptosisprotein,IAP)，表达于人类大多数肿瘤组织，但是在正常成人组织不表达(胸腺除外)［1］，与肿瘤发生、发展及治疗抵抗密切相关。在恶性黑素瘤皮损［2］及其细胞株中［3］都存在survivin过表达。本研究以survivin反义寡核苷酸(antisenseoligonucleotide,ASODN)转染体外培养的恶性黑素瘤细胞株A375，分别用原位杂交和免疫组化的方法检测人恶性黑素瘤细胞survivinmRNA表达及其蛋白水平的变化，初步探讨反义寡核苷酸的作用机制，为survivinASODN治疗恶性黑素瘤提供理论依据。　　1材料与方法9　　1.1材料　　人恶性黑素瘤细胞

6、株A375购于第四军医大学口腔生物学教研室；Oligofectamine转染试剂购自Invitrogen公司；Survivin原位杂交检测试剂盒、DAB显色试剂盒购自武汉博士德生物公司；羊抗人survivin多克隆抗体sc-8806购自SantaCruz公司；SP免疫组织化学试剂盒购自中山生物公司。　　1.2全硫代寡核苷酸设计、合成和修饰　　Survivin反义寡核苷酸序列设计参照文献［4］，由18个碱基组成，序列如下：5＇-TGTGCTATTCTGTGAATT-3＇。寡核苷酸的合成及全硫代磷酸化修饰均由上海生工生物工程技术服务有限公司完成。　　1.3细胞培养　　复苏人源性恶性黑素瘤细胞株

7、A375，用含10mL/L胎牛血清RPMI-1640培养基培养，2-3d传代一次。　　1.4原位杂交测定survivinmRNA9　　将无菌盖玻片放入24孔培养板，以4×104/mL浓度接种细胞，6h后各孔分别置换为不含血清的、含ASODN的试验用培养液0.66mL。ASODN的处理浓度设为20μmol/L，脂质体终浓度为1mL/L。实验分ASODN处理组和空白对照组：①ASODN处理组，即试验用培养液含20μmol/L