靶向survivin的shRNA对恶性黑色素瘤A375细胞survivin基因的表达.pdf

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1、安徽医药ＡｎｈｕｉＭｅｄｉｃａｌａｎｄＰｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌＪｏｕｒｎａｌ２０１５Ｊｕｎｅ；１９（６）·１１６５·靶向ｓｕｒｖｉｖｉｎ的ｓｈＲＮＡ对恶性黑色素瘤Ａ３７５细胞ｓｕｒｖｉｖｉｎ基因的表达１２徐薇，杨超（湖北省襄阳市中心医院、湖北文理学院附属医院１．皮肤性病科；２．肿瘤科，湖北襄阳４４１０２１）摘要：目的探讨靶向ｓｕｒｖｉｖｉｎ的ＲＮＡｉ对恶性黑色素瘤Ａ３７５细胞的影响。方法将对数生长期的恶性黑色素瘤Ａ３７５细胞分为３组，不转染的定为空白对比组，转染ＮＣＧＦＰＬＶ的定为阴性对比组，转染ｓｕｒｖｉｖｉｎＲ

2、ＮＡｉＬＶ的定为阳性观察组，将其经慢病毒载体进行转染并观察效果，对ｓｕｒｖｉｖｉｎ蛋白的表达进行检测，同时实时定量ＰＣＲ检测ｓｕｒｖｉｖｉｎｍＲＮＡ的表达。结果ｓｕｒｖｉｖｉｎｓｉＲＮＡ慢病毒载体得到成功设计与构建，经转染３ｄ，转染率＞８０％，转染ｓｕｒｖｉｖｉｎｓｉＲＮＡ的阳性观察组ｓｕｒｖｉｖｉｎｍＲＮＡ与蛋白的表达明显低于空白对比组（Ｐ＜０．０５），其中阳性观察组ｓｕｒｖｉｖｉｎｍＲＮＡ的表达抑制率达５９．８２％；阳性观察组ｓｕｒｖｉｖｉｎｍＲＮＡ与蛋白的表达明显低于阴性对比组（Ｐ＜０．０５）。结论靶向

3、ｓｕｒｖｉｖｉｎ的ｓｈＲＮＡ可对恶性黑色素瘤Ａ３７５细胞的ｓｕｒｖｉｖｉｎ基因的表达起到显著抑制作用。关键词：ｓｕｒｖｉｖｉｎｇ基因；恶性黑色素瘤；慢病毒载体ｄｏｉ：１０．３９６９／ｊ．ｉｓｓｎ．１００９－６４６９．２０１５．０６．０４７黑色素瘤具有恶性程度高、预后差及发病率低等特进行实时定量ＰＣＲ检测ｓｕｒｖｉｖｉｎｍＲＮＡ水平，在转染３［１］点。根据相关统计显示，恶性黑色素瘤在恶性肿瘤中约ｄ，且转染率达到７０％之后对ｓｕｒｖｉｖｉｎｍＲＮＡ水平用ＲＮＡ提占２％左右。但在世界范围内看，其发病率仍然呈上升趋取试剂Ｔｒｉｚ

4、ｏｌ提取细胞总ＲＮＡ，采用紫外分光光度法测定在［２］势。故本文经利用慢病毒感染率较高，且具有可稳定转样品在波长２６０ｎｍ以及２８０ｎｍ的吸收值，０Ｄ２６０／０Ｄ２８０的染的特点，将慢病毒作为载体，于恶性黑色素瘤Ａ３７５细胞比值介于１．８～２．０表示样品ＲＮＡ纯度优良。采用Ｗｅｓｔｅｒｎ之内，导入ｓｕｒｖｉｖｉｎｓｉＲＮＡ，对其ｓｕｒｖｉｖｉｎ基因的表达进行观ｂｌｏｔ（蛋白免疫印迹实验）检测ｓｕｒｖｉｖｉｎ蛋白的表达情况，在察，报道如下。转染成功之后，用蛋白裂解液（ＲＩＰＡ）进行ｓｕｒｖｉｖｉｎ总蛋白的１材料和方法提取，用Ｂ

5、ＣＡ－１００蛋白质定量测定试剂盒对蛋白浓度进行１．１实验材料由本院中心实验室提供人恶性黑色素瘤细测定。将蛋白样品置于１００℃金属锅变性１０ｍｉｎ，在蛋白变胞株Ａ３７５，ｓｕｒｖｉｖｉｎｓｉＲＮＡ订购成熟产品。实验使用主要试性后经过预电泳（７０Ｖ，３０ｍｉｎ）、一阶段电泳（７０Ｖ，３０剂盒仪器包括ＲＴＰＣＲ试剂盒，ＲＮＡ提取试剂Ｔｒｉｚｏｌ，ＣＯ２培ｍｉｎ）、二阶段电泳（１００Ｖ，９０ｍｉｎ）、转模、脱脂奶粉封闭６０养箱。倒置荧光显微镜、荧光定量ＰＣＲ仪。预染蛋白Ｍａｒｋｍｉｎ、一抗孵育、二抗结合、显影等步骤对ｓｕｒｖｉ

6、ｖｉｎ蛋白的表ｅｒ，ＰＣＲ逆转录试剂盒，ＰＣＲ各引物。ＢＣＡ１００蛋白质定量达强度进行测定。测得强度的表示采用ｓｕｒｖｉｖｉｎ蛋白条带测定试剂盒，蛋白裂解液（ＲＩＰＡ），兔抗人ａｃｔｉｎ抗体，兔抗人的灰度以及内参βａｃｔｉｎ蛋白条带灰度的比值。蛋白抑制率ｓｕｒｖｉｖｉｎ单克隆抗体，辣根过氧化物酶（ＨＲＰ）标记的山羊抗＝（１－ＲＮＡ干扰组ｓｕｒｖｉｖｉｎ蛋白表达强度／空白对比组ｓｕｒ兔ＩｇＧ。ｖｉｖｉｎ蛋白表达强度）×１００％。１．２方法构建ｓｕｒｖｉｖｉｎｓｉＲＮＡ慢病毒载体，进行细胞转染１．３统计学方法采用ＳＰＳＳ

7、１９．０软件进行分析处理，采－△Ｃｔ及培养，将恶性黑色素瘤细胞株Ａ３７５进行复苏，复苏之后采用△Ｃｔ与２表示，应用单因素方差进行分析，以Ｐ＜０．０５用１０％胎牛血清ＤＭＥＭ（高糖）培养基４ｍＬ，在５％ＣＯ２３７℃恒差异具有统计学意义。温箱中进行培养，间隔４～５ｄ进行１次传代，将对数生长期细２结果５胞接种于培养皿，其中对数生长期细胞为每毫升１．０×１０个，ｓｕｒｖｉｖｉｎｓｉＲＮＡ慢病毒载体得到成功设计与构建，经转２培养皿为２５ｃｍ，在细胞长至３０％～５０％融合的时候将其分为染３ｄ，转染率＞８０％。从实时定量ＲＣＲ结果上看，

8、阳性观３组，对３组分别进行转染，上述各组细胞均选取同一代细胞，察组与阴性对比组及空白对比组相较均明显降低，Ｐ＜０．０５并且采用相同的接种、换液时间及培养条件。差异具有统计学意义，具体情况见表１。［８］董万里．阻塞性睡眠呼吸暂停低通气综合征与氧化应激研究［１１］张宝林，王莞尔，刘欣欣，等．微