大鼠心肌细胞内游离钙的fura

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1、大鼠心肌细胞内游离钙的Fura1材料与方法1.1仪器与试剂970CRT荧光分光光度计（上海分析仪器总厂），IGO150型CO2培养箱（Thermoelectroncorporation），601超级恒温水浴孵箱（江苏省金坛市医疗仪器厂），TDZ5-、DMEM、1∶250胰蛋白酶购于SIGMA公司；TritonX-100、EDTA购于上海华美；小牛血清购于北京元亨圣马生物技术研究所；其它试剂均为国产分析纯。1.2实验方法1.2.1实验原理Fura-2具有较强的亲水性，不易透过细胞膜，但能与Ca2+特异性结合，在特定波长的

2、紫外光激发下产生荧光，乙酰羧基甲基酯（Acetoxy-Methylester，AM）具有亲酯性，可透过细胞膜进入细胞。细胞质中的酯酶可将Fura-2/AM水解为游离的Fura-2，Fura-2与细胞内游离的Ca2+结合形成Fura-2-Ca2+复合物，Fura-2及其与Ca2+结合的复合物其最大激发波长分别为380nm和340nm，其发射光的强度与Ca2+浓度呈比例，胞浆Ca2+浓度愈高，Fura-2与Ca2+形成的螯合物愈多，在340nm激发波长处产生的荧光（F340）愈强，而在380nm激发波长处产生的荧光（F38

3、0）愈弱，因此F340/F380可以反映胞浆Ca2+浓度。1.2.2心肌细胞悬液的制备取出生2～3天的SD大鼠，开胸取出心脏，用Hanks液洗涤3次后，剪成1mm3的小块，放入50mL三角烧瓶，加入0.08%胰蛋白酶消化液5mL，在磁力搅拌器上（35～37℃）进行消化，10min后取下吹打混匀后静置，吸弃上清，再加入5mL胰蛋白酶消化液，同样温度消化5～8min后取下静置，收集上清于离心管，并向管中加入少量DMEM培养基及小牛血清终止消化。重复以上过程4～6次，直至将组织块消化，细胞分离完全，以128g离心8～10mi

4、n，吸弃上清液，加入15%小牛血清的DMEM培养基（含庆大霉素4万U/L）混悬沉淀的细胞，以200钼钢网过滤后置入CO2培养箱，37℃静置培养1.5～2h，以差速贴壁法纯化心肌细胞。将细胞密度调至2×106个/mL，0.4%台盼兰染色，活细胞比率大于90%，接种于含无菌载玻片的24孔培养板中，送入通以5%CO2的CO2孵箱中培养，培养24～36h。1.2.3Fura-2/AM的负载去除长有心肌细胞的载玻片孔内的培养基，加入0.25%Fura-2/AM使其终浓度为5μmol/L，含0.2%小牛血清的培养基200μl，CO

5、2孵育箱中37℃孵育40min，负载完毕后，将细胞用胰酶消化下来，离心10min（100g/min），去上清，用Hanks液冲洗2～3次，除去细胞外的Fura-2/AM，重新悬浮成1×106个/mL细胞浓度待用。1.2.4测定细胞悬液的荧光荧光测定采用970CRT荧光分光光度计，测定条件：激发狹缝与发射狹缝均为10nm，灵敏度为2，扫描速度为最快。（1）先扫描测定fura-2/AM标准液、负载液及测定细胞内fura-2的激发光谱和发射光谱，fura-2/AM无Ca2+结合能力，其激发波长和发射波长在加入Ca2+前后变化

6、不大，最大发射波长为490nm，最大激发波长为380nm，负载液的荧光光谱基本上同于此。Fura-2与细胞内游离的Ca2+结合形成Fura-2-Ca2+复合物，最大激发波长从380nm漂移到340nm。固定发射波长490nm，测定激发波长340/380nm的荧光值。（2）加入10%TritonX-100，使终浓度为0.1%，破坏细胞膜，半小时后上机检测最大值，检测340nm、380nm两个波长处的值。（3）加入EDTA，使终浓度为5mmol/L，络合所有的钙离子，使fura-2呈游离状态，半小时后上机检测最小值，检测3

7、40nm、380nm两个波长处的值。1.2.5钙离子浓度的计算上面测得的是相对值，由下列公式计算［Ca2+］i，［Ca2+］i=Kd（FD/FS）×（R-Rmin/Rmax-R）。式中R是实验观察到的荧光比值（F340/F380）,Kd是fura-2与Ca2+反应的解离常数，生理条件下为224nmol/L,Rmax是fura-2全部为Ca2+饱和时的荧光比值，Rmin是fura-2完全未结合Ca2+时的荧光比值，FD和FS分别代表无Ca2+和Ca2+饱和状态下380nm处的荧光强度。细胞自身荧光测定同上，唯不加入fur

8、a-2/AM。在计算R之前应减去未负载fura-2的细胞的自发荧光。fura-2作为新一代荧光探针具有荧光强度高、选择性强、双波长激发等无可比拟的优点。由于fura-2与Ca2+结合后的最大激发波长有较大的漂移（从380nm移至340nm），用这两个光谱的荧光比值作为指标，不仅能提高观察的信号，而且可基本不受细胞密度及荧光剂浓度的