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1、动物血提炼SOD新技术免费公开 一.主要设备:(1)工业用离心机一台;(2)恒温水浴锅(10L--50L)(可自制)1台;(3)冰柜1台;(4)搅拌机1台;(5)玻璃器皿:1000ml,500ml烧杯各3只,50ml烧杯2只,50ml,500ml量杯各1个;(6)塑料桶若干个。下载论文网 二.主要试剂:(工业纯度)柠檬酸钠,柠檬酸,葡萄糖,乙醇90%，氯仿,丙酮,氯化钠,磷酸氢二钠,磷酸二氢钠,去离子水或蒸馏水,葡萄糖凝酸胶SephadexG--100和DEAE--纤维素. 三.试剂的配制:
2、1.抗凝剂配方:(1)柠檬酸钠30g,柠檬酸10g葡萄糖25g加水至1升,一般此种是每7ml血液,加1ml(抗凝剂).(2)40g/升柠檬酸钠溶液:在1升水中加入克的氯化钠. 2.生理盐水:(%)在91克水中加入克的氯化钠. 3.磷酸盐缓冲溶液的配制:,磷酸盐缓冲溶液,一般用,35.61克/升和克/升,前者加,后者加混合后即为PH=缓冲溶液,如果用为/升,为克/升,仍是前者,后者混合后即得. 4.冷却剂:在本工艺中有使用-15度低温,一般用如下配方:用33克食盐加入100克雪或碎冰,以此比例配成
3、混合体可达-度。 四.工艺流程 (一)除血红蛋白 1.血液抗凝处理,在新鲜牛,马,猪血中迅速加入ACD1号抗凝剂,并缓慢搅匀,每7毫升血液中加入抗凝剂1毫升或2号抗凝剂. 2.把抗凝处理的血液放入离心机,以3000r/min离心约15--20分钟,用吸管把上清液(黄色血清)小心吸去抛掉,下层的红血球用2--3倍生理盐水洗2--3次,在每一次洗涤中,用离心机以3000r/min离心,7--8分钟,反复操作后,得到洗涤血红细胞,洗涤后的血红细胞在-15度下冷冻可保存半年并不影响产率和比活,在血液量
4、大,处理不完时必须这样做. 3.在洗净的红血球中加入等体积去离子水,剧烈搅拌30分钟,使红血球细胞壁砍碎,以使其内的SOD浸出.最好在0--4度静止过夜后,把溶血进行有机提取. 4.接着向溶血中缓缓加入倍体积的预冷(-15度)95%乙醇和倍预冷氯仿,搅拌10--15分钟后,原溶血呈浆糊状,静止1--2小时,用滤布除去凝固的血红蛋白,然后将滤液2500r/min离心约1--5分钟留上清液抛去沉淀,此时如果上清液略为微黄色时,可用快速过滤纸过滤,可得到微带蓝色的清澈透明的粗酶液 (二)粗酶液的初步提
5、纯: 1.丙酮提醇:向酶液中加倍量预冷(-15度)丙酮,生成大量白色沉淀,以3000r/min离心2分钟收集沉淀,上清液可不必吸取,直接倾倒. 2.热变性:(除杂蛋白)准备好衡温浴锅,在本工艺中,提前30分钟,注满水接通电源后,使之加热到55--60度以省时间,将沉淀量约50倍量体积比加入=磷酸钠缓冲溶液,水浴加热至60度,15分钟后迅速冷却到室温.3000r/min离心2分钟得上清液,在上清液中,缓缓滴加倍体积的预冷(-15度)丙酮,生成白色沉淀 3.初纯SOD:在上述沉淀中加去离子水,制成2
6、0--30%SOD溶液,分装入样品瓶中,放入冷冻干燥机中,于开机后以真空度,约小时,得到化妆或食品用SOD,该产品比活大于3000u/mg,外观呈微带蓝色的白色冻干品. (三)SOD进一步提纯: SOD精品一般是把SOD产品经过柱层析,柱层析后的SOD没有小分子等杂质,层析后为高活性的SOD大分子.SOD精品价格更高,它主要作为生物化学试剂,化验室标准试剂试用.目前SOD柱层析有两种,二者可单独使用,也可结合使用,一般是DEAE--纤维素层析和SephadcxG--100葡聚糖凝胶层析,将(二)2
7、,热变性后SOD丙酮沉淀用,缓冲溶液溶解,有不溶的杂蛋白时.离心抛去沉淀,上清液上DEAE--纤维素或SephadsxG--100层析柱(1*20cm或*30cm),梯度洗脱,洗脱液为,,NaH2PO4--NaHPO4缓冲液,下流速度控制在/min,在分光光度计上用紫外谱325nm处测流出液,合并活力峰,再用蒸馏水反复透析,透析彻底后,放入样品皿置于冷冻干燥机中干燥后即得SOD精品. 五.注意事项: 1.掌握适当的温度和时间:虽然SOD对热较稳定,但在分离纯化过程中最好还是采用较低温度,一般以0-
8、-10度为宜,时间长不要超过3天. 2.注意提取,提纯方法:使用有机溶剂或者加热均能有效沉淀蛋白质,但掌握适当溶剂和加热结合的办法可以达到最佳效果. 六.SOD的检测方法:活性检验,比较方便的办法是用连笨三酚自氧化法,先测得连笨三酚的自氧化速率,然后加入SOD再测得加入SOD之后的氧化速率,按照酶活性单位定义,即在最佳条件下,每分钟抑制连笨三酚自氧化分解速率达50%的酶量定义为一个酶单位.依次求出活力总值,同时也可以用聚丙烯酰胺凝胶电泳来测定其纯度,
