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1、四川畜牧兽医学院学报2002,16(1)JournalofSichuanInstituteofAnimalHusbandryandVeterinaryMedicineE鹅血SOD的纯化与鉴定李竞肖昌张耕鞠静丽许南萍(西南农业大学荣吕校区生物技术系重庆荣吕402460)摘要新鲜鹅血经氯仿一乙醇分级分离，丙酮沉淀及DEAE纤维素层析的方法得到纯铜锌超氧化物歧化酶(Cu.Zn・SOD).每升鹅血可获得纯化的SOD总活力为231400U,比活力为7713U/mg.经聚丙烯酰胺凝胶电泳后显示出两条带.结果表明用该纯化方法得到的SOD为均一性纯酶.关键词鹅血SOD纯化鉴定中图分类
2、号Q55文献标识码A文章编号1009-0533(2002)01・0001・03超氧化物歧化IW(SuperoxideDismutase)简称SOD,是一类广泛存在丁•多种生物体内的抗氧化猶•旨1969年Mocord等首次从牛红细胞中发现SOD活力以来[IJ,有关该物质的研究空前活跃•迄今为止，人们已经从细菌，真菌，植物和动物等各种生物体内已分离到SOD[2・8].研究表明，由于机体内存在OH.,2等氧自由基，而这些自由基能使脂质过氧化，使生物膜上的O不饱和脂肪酸交联成脂褐素，使结缔组织屮胶原蛋门发生交联而失去弹性•因而损伤生物膜，使生物膜功能受损•而SOD正是这些自由
3、基的犬然清除剂，因而SOD对不少生物人分子特别是生物膜具有保护作用•近年來研究还表明,SOD能和DNA分子结合形成复合物，从而避免由于02引起的DNA突变和细胞衰老.SOD的活性与肿瘤，心血管疾病，炎症，放射病及口身免疫性疾病等有关，因而SOD的研究具有广阔的应用前景.近年來有许多从不同途径提纯SOD的报道，但以鹅血为原料提取SOD未见报道.为全面深入地研究SOD,我们对从鹅血小..提取的SOD进行了研究，同时对其性质进行了鉴定，为鹅血的开发利用提供依据•1材料与方法1.1材料1・1・1鹅血000ml血液取口健康荣吕白鹅.11.1.2试剂DEAE-52为Pharmac
4、ia产品，邻苯三酚，考马斯亮蓝，丙烯酰胺，三轻甲基氨基甲烷，(氮蓝四卩坐)等均为国产分析纯・NBTE收稿日期：2002——0124)李竞(1955-:女，湖北汉口人，硕士，副教授，主要从事动物生化的研究工作•21.2方法四川畜牧兽医学院学报16卷第1.2.1粗酶的制备取新鲜抗凝鹅血1L,离心除去血浆，红细胞用生理盐水洗涤三次得干净）血球，加入3倍体积的去离子水，剧烈搅拌30min,然后依次加入冷乙醉和冷氯仿（-18°C,离心除去变性血红蛋白，上清液在68°C水溶液中加热20min,边加热边搅拌并加入0.009%氯化铜，然后冷却至室温，离心除去下层黄白色杂蛋白，得微带蓝
5、绿色的上清液，取上清液装入透析袋，放入聚乙二醇（分子量为20,000）,溶液浓缩至原液1/50.再加入等量的丙酮使SOD沉淀，离心得SOD沉淀.1.2.2纯酶的分离SOD沉淀用50倍2.5mm的磷酸缓冲液溶解沉淀，离心除去不溶物，将再用95%乙醇沉淀，然后上DEAE-52层析柱，磷酸缓冲液梯度洗脱，得SOD纯酶液.1.2.3蛋白质含量测肚采用半微量定氮法［9］.1.2.4晦活性测定采用邻苯三酚自氧化法［10J.1.2.5纯度鉴定采用聚丙烯酰胺凝胶电泳法［9］.10%聚丙烯酰胺凝胶（分离胶pH8.9）,2.5%聚丙烯酰胺凝胶（浓缩胶pH6.7）,pH8.2电极缓冲液，染
6、色液为0.5%考马斯亮蓝，电流为3-4mA/管，电流时间为3h.NBT活性染色采用Bcauchaup法［11］・2结果与分析2.1鹅血SOD的纯化结果纯化过程中的粗酶液，氯仿，乙醇处理酶液和DEAE-纤维素层析高峰段浓缩液的总活力，总蛋门，比活力和酶活力回收率（1L鹅血），见表1.表1鹅血SOD的分离纯化纯化步骤除血红蛋白后的粗提液氯仿・乙醇处理内酮沉淀DEAE-32层析总活力（U）349000299000249900231400总蛋白（mg）比活力（U/mg）8300270090304211027767713纯化倍数1392276活力回收（%）100857166图1
7、DEAE-52层析分攵锻?SOD图2鹅血SOD聚丙烯酰胺凝胶电泳图谱A考马斯亮蓝染色BNBT活性染色第1期李竞等：鹅血SOD的纯化与鉴定3每升鹅血去血红蛋口的总活力为349000U,经纯化的总活力为231400U,纯化后的比活力为去血红蛋白后的比活力的276倍.林锐等[5]所报道的每升兔血中可提纯13.4mgSOD,余瑞元等[7]所报道的4L鸭血中可提纯28mgSOD,本实验在每升鹅血中能得到30mgSOD,但有资料报道平均每升动物血中可提取50mgSOD,本法略低于资料报道•但本法改进了经典方法，使用加热除去杂蛋白，而避免了使用昂贵的K2HPO4和
