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1、牛血SOD生产新工艺研究从牛血中提取SOD,其关键的步骤之一是除去血红蛋白。传统的工艺采用的乙醇一氯仿法，成本高，工艺复杂，不适合工业化生产。单独使用热变性方法，虽很简单，但除去血红蛋白后的滤液处理步骤不易掌握。为此，我们首先进行了铜锌盐存在下的一次热变性方法除去血红蛋白的研究。3.1.1材料3.1.1.1主要试剂硫酸铜(CuS04•5H20)分析纯北京化学试剂公司硫酸锌(ZnS04•7H』)分析纯北京化学试剂公司铜锌盐溶液：6%的硫酸铜、7%的硫酸锌水溶液配制邻苯三酚分析纯盐酸分析纯三轻甲基氨基甲烷分析纯3.1.1.2主要设备及仪器电热恒
2、温水浴•751-GW紫外分光光度计•微童加样器高速冷冻离心机分析天平贵州遵义化工厂北京化学试剂公司北京化学试剂公司北京长风仪器仪表公司上海分析仪器厂进口eppendorf日本久保田德国赛多利斯3.1.2方法3.1.2.1溶血液的制备取冷冻牛红细胞，加入3倍的去离子水，自然解冻，搅拌溶血3Omin,备用。■3.1.2.2热变性温度试验试验分10组进行，每组取溶血液300ml,反应温度分别选为60C、63"C、669、69*0、72075T?、78C、81C、8代、870将溶血液缓慢加热至所选反应温度,保持10min,迅速冷却至20・C,再30
3、00rpm、30min离心，取上清液，测体积，测定S0D活力，观察上清液的颜色及混浊度，判断其红细胞去除效果。3.1.2.3CuH,Zrf存在下的热变性试验预先准备铜锌盐溶液(6%的硫酸铜、7%的硫酸锌)。试验分6组进行，从热变性温度试验结果中选择出最佳热变性温度作为试验反应温度，取400ml溶血液进行热变性，再分别加入总体积的0.5%,1.0%,1.5%,2.0%,2.5%,3.0%的铜锌盐溶液，搅拌15min,放置lh,3000rpm30nin离心,取上清液，量体积，测定SOD活力，观察上清液的颜色及混浊度，判断其红细胞除去效果。3.1
4、.2.4SOD活力测定采用邻苯三酚自氧化一325nm方法临。邻苯三酚在碱性环境中即可迅速发生自氧化作用，在自氧化过程中产生有色中间物和0「一自由基，反应开始后溶液逐渐变成黄色，在有超氧化物歧化酶存在时，由于它能催化02•-自由基与K结合生成①和Hd从而阻止了中间产物的积累，降低了自氧化速率.中间产物在325nm时有强力的光吸收，使用分光光度计即可检测。邻苯三酚自氧化速率的测定:在试管中按表3・1加入缓冲液，259保温20min,然后加入预热的邻苯三酚(对照管用10咄HC1代替)，迅速摇匀倒入比色杯(光径lcm),在325nm波长下，每隔30
5、秒测一次光吸收值，要求自氧化速率控制在0.070/min・表3・1测定邻笨三盼自氢化速牟的试剂用童表试刑加样査(ml)最终浓度(fflM)pH8.2,50mMTris-HCLM冲液4.55045咄邻苯三酚X(0.01*0.02)0.10总体积4.5*1SOD或粗酶提取液的活力测定：测定时按表3-2所给条件加试剂，测定步骤与自氧化速率测定相同。活力单位定义为：在一定条件下，每毫升反应液中，每分钟抑制自氧化速率达到50%的酶量定义为一个单位(U)。0.070-样液速率W0+50%x反应液总体积x样液稀释倍数样液体积―总活力(U)二单位体积活力(
6、U/加"原液总体积3.1.3结果与分析3.1.3.1热变性温度对S0D活力及除去血红蛋白的影响热变性的不同反应温度对SOD活力的影响及红细胞除去效果见表3.2。表3.2热变性温度对SOD活力的彩响热变性温度(D上清液体积(ml)上清液体积对落血液的百分比(%)单位体积SOD活力(u/m)SOD总活力(U)上渝液浑浊度6028093.33120.8033824.00红色、混6327090.00152.9041283.00红色、泯6623277.33174.2040414.40淡红、%6916254.00249.2040370.40淡红、混72
7、15953.00298.8047509.20淡红、X7514347.67320.1045774.30泯7813244.00291.0038412.008113444.70358.2034598.80清8413546.70166.4022464.00清8713645.3081.1011029.00清试验结果显示，反应温度在72C时，上清液SOD总活力最高(47509.20U),其次为75弋(45774.30U)•当反应温度超过819时，SOD活力急剧下降，当达到87C时总活£1BMl力仅为11029.00U,占721!值的23.2%。热变性反
8、应温度低于729时的结果与有关文献报道不一致，原因可能是由于反应温度过低，红细胞的热变性不彻底，上清液中的红细胞及其他杂蛋白含量较高，从而影响了SOD活力的测定。热变性处理效果可
