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《牛血凝血酶生产新工艺研究》由会员上传分享，免费在线阅读，更多相关内容在工程资料-天天文库。
1、牛血凝血酶生产新工艺研究用高速管式分离机（液液分离转鼓）重液出口分离的血球主要用于SOD的提取，轻液出口分离的血浆主要用于提取凝血酶。凝血酶分离纯化过程包括血浆的预处理、凝而酶原的提取、凝而酶原的激活和粗礙血酶的获得及凝而酶的纯化，几个环节。4.1材料4.1.1原料山东省希森三和集团鲁西肥牛公司新鲜牛血浆新鲜牛血4.1.2主要试剂醋酸分析纯磷酸氢二钠，分析纯磷酸二氢钠分析纯盐酸分析纯氢氧化钠分析纯氯化钠分析纯氯化钙分析纯DEAE-SepharoseFastFlow填料结晶牛血清蛋白北京化学试剂公司北京化学试剂公司北京化学试剂公司北京化学试剂公司北京化学试剂公司北
2、京化学试剂公司北京化学试剂公司AmershamBiosciencesCorp公司上海化学试剂公司礙血酶标准品纤维蛋白原标准品4.1.3主要设备及仪器GF1O5高速管式分离机（裁蔽分离转鼓）美国SIGMA公司美国SIGMA公司上海知正离心机有限公司GQ105高速管式分离机（液固分离转鼓）上海知正离心机有限公司高速冷冻离心机中空纤维超滤器751-GW紫外分光光度计电热恒温水浴微量加样器分析天平210X600mm层析柱(2套)BT0O-300T孀动泵10KD超滤日本久保田天津纺织工学院上海分析仪器厂北京长风仪器仪表公司进口eppendorf德国赛多利斯上海锦华层析设备
3、厂保定兰格恒流泵有限公司Amersham公司4.2HD.浆预处理步骤优化的研究血浆预处理是凝血酶提取过程的第一步骤，也是去除杂蛋白最有效步骤，血浆预处理阶段一般应置于-20・C冷冻2〜3d,自然解冻，稀释。冷冻与否和稀释度的倍数对于凝血酶提纯结果的影响对于凝血酶规模化生产的生产成本影响很大，将对血浆预处理优化研究探讨，以确定規模化提取牛血凝血酶的工艺.4.2.1方法4.2.1.1血浆稀释度对硫活性影响的试验试验分6组进行，将血浆分别以6倍、8倍.10倍.12、14倍的去离了水稀释，提取礙血酶，考査不同稀釋度对凝而酶活的影响.4.2.1.2冷冻对凝血酶提纯的影响试
4、验分3组进行，每组两个对照样，分别为新鲜血浆600ml和新鲜血浆600ml置于-2(TC冷冻2〜3d后的冷冻血浆样品。分别经过相同凝血酶原的提取、凝血酶原的激活和粗凝血酶的获得及凝血酶的纯化步骤。(1)新鲜血浆提取凝血酶取新鲜血浆600ml,用蒸馆水将其稀释10倍，然后用2%的醋酸调pH至5・3,4C静置过夜，虹吸管去掉上层清液，含沉淀部分在3000rpm/min下离心15min,收集沉淀为礙血酶原。将所收集的沉淀溶于0.9%lNaCl溶液中，充分搅拌。然后再向含凝血画原的NaCl溶液中加入10%的CaCl溶液，使其终浓度0.1mol/L,室温放置4〜5h,超滤
5、浓缩得凝血酶粗品。将上述凝血酶粗品上样到0.067mol/LpH6.5磷酸缓冲液平衡好的DEAE-SepharoseFF离子交换柱，经同样缓冲液淋洗后，用含0〜Imol/LNaC1的缓冲液梯度洗脱，流速20ml/h,4ml/管，收集有活性部分，即为凝血酶纯品。(2)冷冻血浆提取凝血酶取新鲜血浆600ml置于-2CTC冷冻2〜3d,自然解冻，在3000rpm/min下离心lOmin,收集上清液。白色胶状物用等体积0〜4匸的0.9%NaCl溶液洗涤30niin,3000rpm/min离心10min,收集上清液.合并两次上清液，用蒸惚水稀释10倍，以下操作步骤同5・1
6、・2・2・1。4.2.1.3蛋白质浓度的测定根据Bradford法测定，以牛血清蛋白为标准，用分光光度计比色。4.2.1.4凝血酶活性的定性检测吸取待测定样品0・1ml于点滴板上，再加0.125%(w/v)纤维蛋白原溶液0.1mL,如果产生凝集现彖，则说明该样品具有凝血酶活性.4,2.1.5^血酶活力的测定⑶取0.125%(w/v)纤维蛋白原溶臧0・4ml,于37匸浴中保温2min,加入待测液0.1mL,迅速摇匀，同时按下秒表开始记时。继续在水浴中保温一定时间(少于预期的凝集时间)，取出试管，轻轻倾斜，观察其中溶液流动情况，直至凝集，记下所需时间,若为15s,则
7、所加眾血酶液为5U/ml。4.2.1.6凝血酶的纯度检测根据SDS—聚丙烯酰胺凝胶电泳测定⑷4・3结果与讨论4.3.1血浆稀释度对酶活性的影响6组不同血浆稀释度提纯凝血酶后得到的酶活性，取其平均值列于表4-1.表4.1血浆稀释度对喙活性的彩响(6组的平均值)称释度(倍)68101214酶活性(U/flil)112160185187188从表4.1可见，血浆的稀释倍数小于8时对酶活性影响较大，10倍以上对酶活性影响趋势变小，考虑到稀释倍数对于后续提纯操作难度和提纯成本的影响，以稀释十倍为宜。4.3.2血浆冷冻与否对提取纯化凝血酶结果的影响（1）洗脱曲线和纯化结果新
8、鲜血浆提取纯化得到的凝血
