银杏叶提取物诱导大鼠主动脉平滑肌细胞中血红素氧合酶

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1、银杏叶提取物诱导大鼠主动脉平滑肌细胞中血红素氧合酶：汪红霞，杨晓瑜，魏宗德，黄维义【摘要】　　目的探讨银杏叶提取物（EGb）诱导大鼠主动脉平滑肌细胞（SMC）中血红素氧合酶-1(HO-1)表达的量效关系，并初步探讨EGb诱导HO-1表达的分子机制。方法复苏并传代培养大鼠主动脉SMC，分组实验，分别采用0，50，100，200，400μg/ml5个不同浓度的EGb以及200μg/mlEGb加放线菌素D（ActD）孵育SMC8h，C中HO-1表达，且这种表达在一定范围内具有量效关系；EGb诱导HO-1表达有赖于基因重新转录。【关键词】银杏叶提取物大

2、鼠主动脉平滑肌细胞血红素氧合酶-1　　Abstract：ObjectiveToexplorethedose-effectrelationshipandthemolecularmechanismofthehemeoxygenase-1(HO-1)expressioninducedbytheextractofGingkobiloba(EGb)inrataortasmoothmusclecells(SMC).MethodsTheSMClandEGb200μg/ml+ActD4μmrespectively.Theincubationlastedfor8

3、hours,thenC中HO-1表达作用作初步探讨。　　1材料与方法　　1.1材料　　大鼠主动脉平滑肌细胞株（Smoothmusclecell,SMC）第3代由四川大学华西医院传染科侯洁博士赠送；细胞培养试剂包括DMEM/F12、胎牛血清、胰蛋白酶、二甲基亚砜等购于美国Gibco公司；银杏叶提取物（金纳多注射液）购于德国C株第3代并传代培养至第6代，再以每孔4×105个细胞转至6孔板中继续培养；当SMC生长密度达到80%左右时使用含1%胎牛血清的培养基预处理24h使细胞生长同步化。分组实验，每组5个复孔：①EGb诱导实验：分为A，B，C，D，E

4、组，分别加入0，50，100，200，400μg/ml5种浓度的EGb孵育细胞8h。②ActD阻断实验：分为对照组、EGb组及EGb+ActD组，分别加用等浓度的空白液、EGb200μg/ml及EGb200μg/ml+ActD4μm，孵育细胞8h。随后收集细胞，加入细胞裂解液300μl，冰上充分振荡裂解1h，高速低温离心取上清液提取蛋白。BCA法测蛋白含量后，样品蛋白和上样缓冲液按3∶1的比例混匀后，沸水浴中煮沸5min使蛋白变性，短暂离心去除沉淀；制备聚丙烯酰胺凝胶，用微量加样器将已经处理好的样品以每孔30μg上样，并用β-actin（分子量

5、42KD）作为内参校正上样量，电压200v，电流50mA，电脉2h；考马斯亮蓝染色观察蛋白条带；电转移1h后用脱脂奶粉封闭PVDF膜；TBST洗膜后加入抗体（一抗稀释度1∶5000，室温下2h；二抗稀释度1∶10000，室温下1h）；ECL法免疫荧光显像。用Image-ProPlus图像分析软件对HO-1条带进行分析，以HO-1条灰度值代表HO-1的表达量。　　2.2ActD阻断实验各组的HO-1蛋白表达3组中HO-1蛋白条带显影程度各有不同，EGb组条带明显加深，而EGb+ActD组条带明显变浅，详见图2。灰度值分析：EGb组诱导的HO-1表

6、达量显著高于对照组，EGb+ActD组HO-1蛋白表达受抑，明显低于EGb组，详见表2。表2ActD阻断实验组蛋白印迹图像分析结果(略)　　3讨论　　HO-1即热休克蛋白32（HSP32），分子量为32kD，是细胞内的一种重要的抗氧化酶。HO-1连同其酶解产物胆红素、CO一起组成了机体重要的保护系统，广泛参与抗氧化、抗炎、抗细胞增殖、调节血管张力，参与细胞内信号传递等重要作用［2，3］。用免疫组化染色和原位杂交的方法研究已证明，在人和实验动物AS斑块巨噬细胞、肥大细胞和内皮细胞内，HO-1是高表达的，这种适应性的高表达被认为具有抗AS的积极意义

7、［4］。研究显示，增加HO-1表达能有效抑制AS的发生，反之，若用药物阻断HO-1活性则可使AS病变程度显著加重，表明HO-1系统在防止AS中起着重要作用，故合理调控HO-1表达可望成为有效防治AS新途径。HO-1本质上是一种应激酶，具有高度可诱导性，但因HO-1基因启动区内存在着许多特殊的调控位点，诱导HO-1表达的信号通路非常复杂。众多致氧化应激损伤的因素如H2O2、重金属离子、内毒素、OX-LDL等均是通过改变细胞内氧化-还原状态来诱导HO-1的表达。一些生物黄酮在近年被证明是无细胞毒性的HO-1诱导剂，有着光明的临床应用前景。EGb是传

8、统中药银杏中的一种标准提取物，主要成分为黄酮类和萜类内酯化合物，近来揭示，EGb是一个天然的HO-1增效药，EGb的抗氧化作用可能更主要通过诱导HO-