人表皮生长因子基因重组腺病毒穿梭质粒的构建

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1、人表皮生长因子基因重组腺病毒穿梭质粒的构建　　表皮生长因子(epidermalgroancDNAEGF序列，获得hEGFcDNA全序列(NM_001963)，选择合成EGF基因的信号肽(signalpeptide,sp)片段(NM_001963,nt453-nt518)加hEGF基因分泌肽片段(NM_001963,nt3363-nt3521)，sp-hEGF融合基因全长为234bp，由南京金斯瑞生物科技公司用化学合成法行全基因合成。Sp-hEGF基因合成时，在上游5端引入NheI酶切位点,下游3端引入SalⅠ酶切位点。　　1.3克隆载体pUC

2、57-hEGF构建和鉴定　　取sp-hEGF基因片段6μL,T4DNA连接酶1μL，pUC57质粒1μL，反应体系如下：Buffer缓冲液2.5μL,ddH2O14.5μL,16℃恒温水浴过夜。取15μL连接产物转化至感受态细胞DH5a[4]中，涂布在含氨苄的培养基上，37℃培养过夜，挑取较大白色菌落，扩增培养后提取质粒，并做NdeⅠ、HindⅢ双酶切鉴定。　　1.4穿梭表达质粒pYr-ads-6-hEGF构建和鉴定　　依次用限制性内切酶NdeI、SalI分别酶切克隆质粒pUC57-sp-hEGF和腺病毒穿

3、梭质粒pYr-ads-6，将酶切后的sp-hEGF基因片段通过T4DNA连接酶克隆到穿梭质粒pYr-ads-6上。反应体系为:缓冲液1.5μL，载体DNA1μL，目的基因DNA7μL,T4DNA连接酶1μL，ddH2O4.5μL。轻轻混匀后，16℃连接过夜，次日将混合液转化到感受态DH5a细胞，产物涂布于含卡那霉素的培养基上，37℃培养过夜。次日挑选平板上较大的白色菌落，在培养基中扩增。按质粒提取试剂盒说明，获得重组质粒pYr-ads-6-hEGF。限制性内切酶NdeI和SalⅠ双酶切重组质粒，挑选正确的阳性克隆

4、，送南京金斯瑞生物科技公司测序。　　2结果　　2.1pUC57-hEGF质粒酶切鉴定　　pUC57-hEGF质粒的阳性克隆经HindIII和NdeⅠ双酶切，切出2.4Kb载体带和约540bp含有sp-hEGF的小带。　　2.2pYr-ads-6-sp-hEGF质粒酶切鉴定将sp-hEGF片段亚克隆至pYr-ads-6载体后，所获阳性克隆经NdeⅠ与SalⅠ进行酶切，可切出约650bp的小带和5.8Kb的大带。初步推测sp-hEGF基因片段已经克隆到pYr-ads-6载体。阳性克隆测序所得的序列和sp-hEGF基因片段进行比对，显示构建序列与预

5、计碱基序列无差异，提示hEGF腺病毒穿梭质粒构建成功。　　3讨论　　要想表达人表皮生长因子，转入原核质粒虽可获得大量重组蛋白，但原核质粒表达的重组蛋白缺乏相应的翻译后修饰，难以获得真正意义上的活性蛋白质。而在真核表达体系中，可通过信号肽引导分泌性蛋白质到达内质X，经修饰后，再经高尔基复合体囊泡运输可至胞外，从而发挥生物学效应。可见蛋白质在向细胞外分泌的过程中，有赖于信号肽的介导。多个研究证明，信号肽主要功能是调节蛋白前体折叠，引导蛋白质穿膜运转，对蛋白质的分泌有至关重要的作用。　　目前获取目的基因的方法主要有3种：反向转录法、从细胞基因组直接

6、分离法和人工化学合成法。人工化学合成全基因目前是准确率最高，速度最快的方法。我们通过检索NCBIGenBank数据库获取人cDNAEGF全基因序列为4875bp，全部用化学合成难度较大，且片段越大，成功转入质粒概率越小。为提高合成基因的成功率和降低后续插入载体的难度，选取hEGF信号肽加分泌肽基因片段，以使该融合基因在转染细胞后能更好的分泌生长因子。现有研究表明，在不更改氨基酸组成的条件下，DNA序列通过人工合成可提高蛋白表达量。基因化学合成虽然不像PCR那样能实现迅速高效的扩增，但却有着不需要模板，直接面向序列等无法替代的优势，可大大缩短制

7、备目的基因的时间。　　后续实验中,拟将pYr-ads-6-hEGF质粒进一步做腺病毒包被，并感染脂肪干细胞，用于全层皮损的修复研究，考虑到到干细胞不易被转染的特点，选择了腺病毒穿梭质粒作为hEGF表达载体。因腺病毒载体宿主范围广，可感染分裂和非分裂细胞、转染效率高、病毒滴度浓度可控、外源基因装载容量大等优点，已成为基因治疗研究中常用的转基因载体。本实验中选择的pYr-ads-6质粒带有绿色荧光蛋白(GFP)基因，其示踪作用有助于在后续试验中，更好地了解目的基因在转染细胞中的位置、扩散范围和作用时相。pUC57-hEGF质粒若采用克隆位点Nhe

8、I和SalⅠ酶切，应会切出约250bp的目的基因片段带和2.7Kb的大带。但因250bp片段条带不明显，故换用质粒上的HindIII和NdeⅠ进行酶切，得到540b