酵母穿梭质粒的构建初稿

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1、酵母穿梭质粒的构建的初稿一、实验目的1.学习构建穿梭质粒的原理2.掌握构建人工质粒的方法二、实验原理所谓穿梭质粒是指是指一类由人工构建的具有两种不同复制起点和选择标记，因而可在两种不同的寄主细胞存活和复制的质粒载体。此概念不仅用于不同的微生物菌群之间，也可以推广到真核生物表达载体的构建，如用于枯草的pBE2、酵母的pPIC9K、哺乳动物表达载体pMT2和用于植物细胞的Ti质粒。这些穿梭质粒不仅可以在大肠杆菌中复制扩增，也可以在相应的枯草、酵母、动物或植物细胞中扩增和表达。这样利于对质粒的分子生物学操作和大量制备。本实验采用的是大肠杆菌的pBR322和酵母菌的ARS

2、403来构建穿梭质粒，使其既能在大肠杆菌中复制，又能在酵母菌种表达复制。ARS(autonomouslyreplicatingsequence自主复制序列)是染色体自主复制序列,是从酵母中克隆的真核细胞DNA复制起点序列。酵母每条染色体由多个复制子组成,复制子平均长度为36kb。整个基因组约由400多个复制子组成。ARS403是酵母第四号染色体上的第三个自主复制序列，通过提取酵母基因组DNA，设计合适的引物并加以酶切位点进行PCR即可得到ARS403，再以相同的限制性内切酶进行双酶切质粒和所得到的ARS403，进行酶连和重组子的筛选以及鉴定即可得到我们想要的穿梭质

3、粒。三、仪器、材料和试剂1、仪器：微量移液器、Eppendorf管、台式高速离心机、常用玻璃仪器、电泳仪、电泳槽、凝胶成像系统、恒温摇床、超净工作台、大肠杆菌DH5α、2、材料：含有pBR322的大肠杆菌，大肠杆菌DH5α，酵母菌3、试剂：（1）质粒提取试剂（2）酵母菌基因组提取试剂：SCED(1mol/L山梨醇、10mmol/L柠檬酸钠、10mmol/LEDTA、10mmol/LDTT二硫苏糖醇)溶菌酶2%SDS5mol/LKAc(pH8.9)乙醇饱和酚和氯仿RNase(10mg/ml)TE(10mmol/LTris-HCl，pH7.4，1mmol/LEDTA，

4、pH8.0)7.5mol/LNH4Ac(pH7.5)（3）PCR体系（4）酶切试剂（5）酶连试剂其他的自己看着写三、操作步骤（一）质粒DNA的提取1、培养细菌:将带有质粒pBR322的大肠杆菌单菌落接种到LB液体培养基中，37℃震荡培养8-16h2、去液体培养基1.5mL于Eppendorf管中，转速10000rpm/min离心5min，去掉上清液，加入预冷的150μLGET溶液，用枪头充分混匀后，放到冰上；3、加入300μL新配置的变性液，轻柔混匀4-5次，冰上放置5min；4、加入150μL冰冷的醋酸钾溶液（pH4.8），颠倒数次混匀后，冰上放置不超过5min

5、；5、用台式高速离心机，10000rpm/min离心10min，将上清液（约600μL）移入另一干净离心管，并加等体积异丙醇混匀，室温放置5min后，12000rpm/min离心5min；弃去上清液6、沉淀用1ml70%乙醇清洗一次，离心管倒置于吸水纸上，除尽乙醇，室温自然干燥；1、加入20μL含有RNase20μL/mL的TE缓冲液或灭菌蒸馏水溶解提取物，室温放置30min以上，是DNA充分溶解。（一）酵母基因组DNA的提取1、接种酵母培养基中(YPD培养基)，摇床培养30℃，培养16～18h；2、取1.5ml酵母培养液，室温下，12000rpm，离心8min，

6、收集菌体；菌体用灭菌水洗1次，12000rpm，离心5min；3、弃上清，菌体用200μlSCED(1mol/L山梨醇、10mmol/L柠檬酸钠、10mmol/LEDTA、10mmol/LDTT二硫苏糖醇)溶液重悬，加入30μl10mg/ml溶菌酶37℃温浴1h；4、加入100μl2%SDS混匀，－20℃冰冻，然后室温震荡溶解，反复3次；5、向悬浮液中加入150μl5mol/LKAc(pH8.9)轻轻混匀，然后10000r/min离心5min；6、将上清转移到一新的1.5ml离心管中，加入2倍体积的乙醇，轻轻混匀，室温放置5min后12000r/min离心10mi

7、n；7、除去上清，将沉淀溶解在300μlTE(10mmol/LTris-HCl，pH7.4，1mmol/LEDTA，pH8.0)中，加入6μlRNase(10mg/ml)，37℃温浴30min；8、加入饱和酚和氯仿各150μl充分混匀，然后10000r/min离心5min；9、转移上清到新的1.5ml离心管中，加入1/2体积的7.5mol/LNH4Ac(pH7.5)和等体积的异丙醇，－20℃放置20min后12000r/min离心10min；10、除去上清，加入300μl70%乙醇漂洗沉淀一次，10000r/min离心5min；风干除去乙醇，用20μlTE溶解酵母

8、DNA。（