酪氨酸激酶etk的表达与鼻咽癌细胞凋亡之间的关系

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1、酪氨酸激酶Etk的表达与鼻咽癌细胞凋亡之间的关系苏珊张健郭琳琅朱伟良张振华【摘要】　　目的：观察酪氨酸激酶Etk的表达与放射引起的鼻咽癌细胞株凋亡之间的关系，探讨Etk对放射引起的鼻咽癌细胞凋亡的调节机制.方法：运用免疫荧光技术和流式细胞术检测4株鼻咽癌细胞Etk的表达情况；直线加速器6MVX射线2Gy单次剂量照射细胞后，用流式细胞仪检测细胞凋亡率的变化，以及与Etk,凋亡相关蛋白Bcl2及Bak表达的关系.结果：流式细胞仪检测显示4株鼻咽癌细胞Etk表达水平分别为：58F（73.3±3.4）%,610B（50.5±6.1）%,E1（47.7±1.9）%,E2（2

2、9.5±1.7）%.免疫荧光显示，Etk蛋白主要在鼻咽癌细胞胞质中表达，胞核中表达微弱.统计分析表明，放射线照射后，鼻咽癌细胞株Etk的表达降低，并与细胞的凋亡率及Bak蛋白的表达呈负相关，与Bcl2的表达无关.结论：Etk蛋白与放射引起的鼻咽癌细胞凋亡有关，它可能通过调节凋亡蛋白Bak的表达参与了放射后鼻咽癌细胞的凋亡.【关键词】鼻咽肿瘤蛋白质酪氨酸激酶Etk细胞凋亡0引言内皮/上皮细胞酪氨酸激酶(Theendothelial/epithelialtyrosinekinase,Etk)，是蛋白酪氨酸激酶（Brutonstyrosinekinase,Btk）家族中惟一一种

3、不仅分布于淋巴造血细胞，还在上皮性瘤细胞和血管内皮细胞中表达的非受体类酪氨酸激酶〔1〕.国外研究表明，Etk与T,B淋巴细胞的增殖、分化关系密切，并对乳腺癌、前列腺癌等癌细胞的增殖和凋亡起重要的调节作用〔2-3〕.我们最近报道，在鼻咽癌组织中也存在Etk的异常表达，并与EBER1（EBVEncodedRNA）的表达相关,而与凋亡相关蛋白Bcl2的表达无关〔4〕.本研究我们利用直线加速器对鼻咽癌细胞进行照射，用流式细胞仪检测照射前后细胞的凋亡率及Etk，Bcl2和Bak的表达，探讨Etk与放射后鼻咽癌细胞凋亡之间的关系及其可能调节机制.1材料和方法1.1材料兔抗人Etk多

4、克隆抗体购自美国CellSingnaling公司；FITC标记羊抗兔IgG购自美国CHEMICON公司；兔抗人Bak多克隆抗体及兔抗人Bcl2多克隆抗体购自福州迈新生物技术公司；AnnexinVFITC凋亡试剂盒购自美国BeckmanCoulter公司；RMPI1640培养液购自美国GIBCO公司；新生牛血清购自奥地利PAA公司.细胞株：高成瘤、高转移的低分化鳞癌细胞株58F及低成瘤、不转移的低分化鳞癌细胞株610B由南方医科大学病理学研究室馈赠,高分化细胞株E1,低分化细胞株E2由中山医科大学病理学研究室馈赠.1.2方法1.2.1细胞培养加入含150mL/L灭活

5、新生牛血清的RMPI1640培养液，置于37.5℃，饱和湿度50mL/L的CO2培养箱中培养.收集融合率70%~80%，存活细胞百分率>95%的对数生长期细胞以备实验.1.2.2免疫荧光技术鼻咽癌细胞在预处理过的盖玻片上培养24h至70%~80%细胞融合，PBS洗涤3次，丙酮冰上固定15min，洗涤3次后加入兔抗人Etk多抗（稀释浓度1∶100），37℃温育2h，洗涤后加入FITC标记羊抗兔IgG抗体（稀释浓度1∶50），37℃温育1h，PBS洗涤后封片，于荧光显微镜下观察.1.2.3直线加速器照射产地：美国Varian公司，6MVX射线，剂量2Gy，剂量率4Gy/m

6、in,照射野15cm×30cm.1.2.4流式细胞仪分析①鼻咽癌细胞株照射前后Etk的表达：分别收集照射前与照射后6,12h的鼻咽癌细胞，50g/L多聚甲醛固定15min，PBS洗涤后，破膜剂裂解细胞，加入兔抗人Etk多抗（稀释浓度1∶100），孵育1h，再次洗涤离心，加入FITC标记羊抗兔IgG抗体（稀释浓度1∶50），孵育0.5h后，在流式细胞仪上检测Etk蛋白的表达，出现绿色荧光的细胞为Etk蛋白表达阳性.②采用上述相同的方法，检测放射线照射前后细胞Bcl2,Bak蛋白的表达水平.③照射后鼻咽癌细胞的凋亡率：收集照射后12h的鼻咽癌细胞，PBS洗涤离心后，1×bind

7、ingbuffer(结合缓冲液)调整细胞浓度为5×109/L，取100μL与5μLFITC及2.5μLPI溶液混匀，冰上避光孵育10min，加入400μL1×bindingbuffer混匀后，应用美国BectonDickson公司的FACSort型流式细胞仪进行分析.统计学处理：数据采用统计软件SPSS10.0，结果用x±s表示，差异比较采用t检验，并进行Spearman相关分析.2结果2.1流式细胞仪检测照射前4株鼻咽癌细胞Etk表达的阳性率，从高到低依次为：58F（73.3±3.4）%,610