肿瘤坏死因子

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1、肿瘤坏死因子　　　　孙嗣国，马保安，周勇，范清宇【关键词】,肿瘤坏死因子Osteoclastformationandboneresorptioninducedbytumornecrosisfactorα　　　　【Abstract】AIM:Toinvestigateornecrosisfactorα(TNFα)caninduceosteoclastformationfromperipheralbloodmononuclearcells(PBMCs)independentofreceptoractiva

2、torofnuclearfactorkappaBligand(RANKL).METHODS:PBMCsacrophagecolonystimulatingfactor（MCSF）andTNFαinvitro.RANKLblockingagentRANK:FcandneutralizingantiTNFαantibodyarkerofosteoclast.Lacunaresorptionondentineslices,afunctionalmarkerofosteoclast,icroscopyand

3、lightmicroscopy.RESULTS:TNFαinducedtheformationofmultinucleatedcells(MNCs)ationondentineslices.RANK:FcdidnotinhibitthisprocessationofMNCsandlacunaresorption.CONCLUSION:InthepresenceofMCSF,TNFαcandirectlyinducemononuclearphagocyteosteoclastprecursorstod

4、ifferentiateintoosteoclasticcellscapableoflacunaresorption.　　【Keyononuclearcells,PBMCs)及RAEM中加入100u/mL青霉素，10mg/L链霉素和10mmolL谷氨酸及100mL/L胎牛血清(Invitrogen,UK)配制成完全培养基(MEM/FBS)；重组人巨噬细胞克隆刺激因子（MCSF）、鼠可溶性细胞核因子κB受体活化因子配体(solvablereceptoractivatorofnuclearfactork

5、appaBligand,sRANKL)、RANKL拮抗剂（RANK:Fc），TNFα，IL1α，抗TNFα中和抗体均购于RDSystems公司（UK），抗酒石酸酸性磷酸酶(TRAP)试剂盒购于Sigma公司（UK）.　　1.1.2动物及细胞系6~9厚,再冲压成直径4mm的圆形骨片,超声波处理,消毒备用.　　1.2方法　　1.2.1小白鼠PBMCs的分离、培养及试验分组将小白鼠外周血按1∶4稀释于MEM后缓慢加到histopaque(Sigma,UK)表面,离心(693g)30min.吸取处于界面层的

6、细胞，重悬于MEM并离心（600g）10min，重复两次，然后重悬于MEM/FCS.50mL/L醋酸溶解红细胞后，细胞记数板记数PBMCs.事先将灭菌的4mm直径的象牙磨片和直径6mm的玻璃盖玻片分别放入96孔细胞培养板.将2×105PBMCs加入放有象牙磨片或盖玻片的96孔细胞培养板，调整培养液(MEM/FBS)至总体积0.1mL；孵育2h后将象牙磨片及玻璃盖玻片取出，并在MEM/FCS中充分涮洗以去除非黏附细胞，然后转移到24孔组织培养板，培养板内加入各种因子并调整培养基至总体积为1mL.每3日

7、更换培养液及各种因子.实验分组：A组加入25μg/LMCSF和10μg/LIL1α作为阴性对照；B组加入25μg/LMCSF和30μg/LsRANKL作为阳性对照；C组加入25μg/LMCSF，10μg/LIL1α和不同浓度的TNFα；D组E组加入25μg/LMCSF，10μg/LIL1α和25μg/LTNFα，分别再加入100μg/L的抗TNFα中和抗体和RANK:Fc.　　1.2.2RAEM/FCS及2块玻璃盖玻片或3块象牙磨片的24孔细胞培养板中，调整培养液至总体积为1mL.孵育2h后将盖玻片

8、和象牙磨片取出并在MEM/FCS中充分涮洗，去除非黏附细胞后放入新的24孔细胞培养板，培养板内加入各种因子并调整培养基至总体积为1mL,每2日更换培养液及各种因子.实验分组：A组加入25μg/LTNFα和10μg/LIL1α;B组加入10μg/LIL1α作为阴性对照；C组加入30μg/LsRANKL作为阳性对照.　　1.2.3破骨细胞的鉴定于孵育24h中止部分象牙磨片和玻璃盖玻片上的细胞培养并鉴定,以排除PBMCs中含有成熟OC的可能.再于9d，14d分别终止玻璃盖玻