砒霜纳米乳治疗小鼠lewis肺癌的效果初步评价

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1、砒霜纳米乳治疗小鼠Lewis肺癌的效果初步评价作者：许严伟，杜钢军，林海红，宋紫辉，张硕，王梅【摘要】　　目的评价砒霜纳米乳治疗小鼠LeulsiononLemunity.MethodsTheproliferationandcellcycleofA549cellsinedbyMTTassayandfloetryrespectively.Theantitumorofarsenicorinjectedsubcutaneouslyinmiceanditstoxicitytoimmunityinedbyclearancerateofcharcoalparticlesanddelayedtypehy

2、persensitivity.ResultsArsenicnano-emulsionanditsulsioninmice.ConclusionArsenicnano-emulsionhasbettertherapeuticactiononLeedose,anditalsoreducestoxicitytoimmunity.　　Keyulsion；Lemunity　　肿瘤在人类死亡的主要疾病中居第2位，近年来发病率呈逐年上升趋势［1］。尽管目前已有多种治疗肿瘤的方法问世，由于肿瘤早期不易被发现的特点，化疗在肿瘤的治疗中一直处于主导地位。但因目前化疗药物对肿瘤的杀伤缺乏选择性，在杀死肿瘤细胞

3、的同时对机体的正常细胞也产生较大毒性，临床上往往因病人不能耐受化疗药物的毒性最终导致肿瘤治疗失败［2］。中药砒霜在祖国医学中曾被用于治疗恶性肿瘤等多种疾病，但由于它是一种剧毒物质，其药用价值一直被其毒副作用所掩盖。自1996年《Science》杂志报道［3］的三氧化二砷（As2O3）成功治愈急性早幼粒细胞性白血病(APL)的成果以来，对As2O3药理作用的探索引起了世界医学界的重视，在我国对砒霜的研究也成为开发抗肿瘤药物的热点之一［4］。我们将砒霜制成纳米乳剂，以发病率较高的肺癌为肿瘤对象，研究砒霜的抗肿瘤作用及其对免疫功能的损害，以期探索更好利用砒霜的新途径。　　1材料与仪器　　1.1

4、动物C57B/6小鼠，雌性，18～22g，购自北京维通利华实验动物有限公司；昆明种小鼠，雌性18～22g，购自河南省实验动物中心。　　1.2瘤株Lel的RPMI-1640在37℃，5%CO2恒温培养箱中培养,实验时选用对数生长期的细胞。　　1.3试剂与药品RPMI-1640和MTT，Sigma产品；胎牛血清，杭州四季青公司；司盘80，国药集团化学试剂有限公司生产，批号F20061117；吐温80，天津市红岩化学试剂厂生产，批号060824；印度墨汁，北京笃信精细制剂厂生产，批号040823；DNCB，上海华硕精细化学品有限公司生产，批号040928；砒霜，河南大学一附院中药房提供。　　1

5、.4仪器　　100级洁净工作台，上海博迅实业有限公司医疗设备厂生产；KQ-500DB型数控超声波清洗器，昆山市超声仪器有限公司；TDL-50B型台式离心机，上海安亭科学仪器厂生产；XD-101型倒置生物显微镜，南京江南光电（集团）股份有限公司；ELX800型酶标仪，美国BIO-TEK。流式细胞仪，美国BD公司。　　2方法　　2.1纳米乳的制备［5］称取砒霜80mg加入到2ml碱性蒸馏水中（0.1MNaOH），使其完全溶解,无菌过滤后作为水相。取4∶1∶1比例的灭菌豆油、司盘80和吐温80，使其混匀溶解后加入水相，加热至50℃，以适量5M柠檬酸溶液调节pH值至7.0～7.5超声波振荡器振荡

6、1h即得均一透明纳米乳，100×油镜下估计1μm内约20个乳滴。同时以同样量的水相制备空白纳米乳。　　2.2MTT检测［6］取对数生长期的A549细胞,用0.25%的胰酶消化,调细胞数5×104/ml,以100μl/孔接种于96孔板中,培养24h后加补充含不同浓度砒霜（纳米乳或水溶液）的培养基100μl/孔,每组6个复孔。48h后，除去培养基，加含MTT5mg/ml的PBS100μl/孔，继续培养4h后除去孔内的液体,加入DMSO100μl/孔,振荡10min,在酶标仪上570nm处测吸光度(OD),按下式计算细胞的存活率：　　存活率(%)=给药孔平均OD值对照孔平均OD值×100%　　

7、2.3流式细胞仪检测取对数生长期A549细胞,用0.25%的胰酶消化,调细胞数3×105/ml,以3ml/瓶接种于培养瓶中,培养24h后加补充含不同浓度砒霜（纳米乳）的培养基3ml/瓶,每组3个复瓶。48h后终止培养,消化并收集细胞，PBS洗2次,70%冷乙醇固定30min。PBS洗涤2次后加入Rnase酶消化10min,1500r/min离心5min,弃上清液，PBS重悬后加碘化丙锭（终浓度20μg/ml）染色15min,流式细胞