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1、砒霜纳米乳治疗小鼠Lewis肺癌的效果初步评价作者:许严伟,杜钢军,林海红,宋紫辉,张硕,王梅【摘要】 目的评价砒霜纳米乳治疗小鼠LeulsiononLemunity.MethodsTheproliferationandcellcycleofA549cellsinedbyMTTassayandfloetryrespectively.Theantitumorofarsenicorinjectedsubcutaneouslyinmiceanditstoxicitytoimmunityinedbyclearancerateofcharcoalparticlesanddelayedtypehy
2、persensitivity.ResultsArsenicnano-emulsionanditsulsioninmice.ConclusionArsenicnano-emulsionhasbettertherapeuticactiononLeedose,anditalsoreducestoxicitytoimmunity. Keyulsion;Lemunity 肿瘤在人类死亡的主要疾病中居第2位,近年来发病率呈逐年上升趋势[1]。尽管目前已有多种治疗肿瘤的方法问世,由于肿瘤早期不易被发现的特点,化疗在肿瘤的治疗中一直处于主导地位。但因目前化疗药物对肿瘤的杀伤缺乏选择性,在杀死肿瘤细胞
3、的同时对机体的正常细胞也产生较大毒性,临床上往往因病人不能耐受化疗药物的毒性最终导致肿瘤治疗失败[2]。中药砒霜在祖国医学中曾被用于治疗恶性肿瘤等多种疾病,但由于它是一种剧毒物质,其药用价值一直被其毒副作用所掩盖。自1996年《Science》杂志报道[3]的三氧化二砷(As2O3)成功治愈急性早幼粒细胞性白血病(APL)的成果以来,对As2O3药理作用的探索引起了世界医学界的重视,在我国对砒霜的研究也成为开发抗肿瘤药物的热点之一[4]。我们将砒霜制成纳米乳剂,以发病率较高的肺癌为肿瘤对象,研究砒霜的抗肿瘤作用及其对免疫功能的损害,以期探索更好利用砒霜的新途径。 1材料与仪器 1.1
4、动物C57B/6小鼠,雌性,18~22g,购自北京维通利华实验动物有限公司;昆明种小鼠,雌性18~22g,购自河南省实验动物中心。 1.2瘤株Lel的RPMI-1640在37℃,5%CO2恒温培养箱中培养,实验时选用对数生长期的细胞。 1.3试剂与药品RPMI-1640和MTT,Sigma产品;胎牛血清,杭州四季青公司;司盘80,国药集团化学试剂有限公司生产,批号F20061117;吐温80,天津市红岩化学试剂厂生产,批号060824;印度墨汁,北京笃信精细制剂厂生产,批号040823;DNCB,上海华硕精细化学品有限公司生产,批号040928;砒霜,河南大学一附院中药房提供。 1
5、.4仪器 100级洁净工作台,上海博迅实业有限公司医疗设备厂生产;KQ-500DB型数控超声波清洗器,昆山市超声仪器有限公司;TDL-50B型台式离心机,上海安亭科学仪器厂生产;XD-101型倒置生物显微镜,南京江南光电(集团)股份有限公司;ELX800型酶标仪,美国BIO-TEK。流式细胞仪,美国BD公司。 2方法 2.1纳米乳的制备[5]称取砒霜80mg加入到2ml碱性蒸馏水中(0.1MNaOH),使其完全溶解,无菌过滤后作为水相。取4∶1∶1比例的灭菌豆油、司盘80和吐温80,使其混匀溶解后加入水相,加热至50℃,以适量5M柠檬酸溶液调节pH值至7.0~7.5超声波振荡器振荡
6、1h即得均一透明纳米乳,100×油镜下估计1μm内约20个乳滴。同时以同样量的水相制备空白纳米乳。 2.2MTT检测[6]取对数生长期的A549细胞,用0.25%的胰酶消化,调细胞数5×104/ml,以100μl/孔接种于96孔板中,培养24h后加补充含不同浓度砒霜(纳米乳或水溶液)的培养基100μl/孔,每组6个复孔。48h后,除去培养基,加含MTT5mg/ml的PBS100μl/孔,继续培养4h后除去孔内的液体,加入DMSO100μl/孔,振荡10min,在酶标仪上570nm处测吸光度(OD),按下式计算细胞的存活率: 存活率(%)=给药孔平均OD值对照孔平均OD值×100%
7、2.3流式细胞仪检测取对数生长期A549细胞,用0.25%的胰酶消化,调细胞数3×105/ml,以3ml/瓶接种于培养瓶中,培养24h后加补充含不同浓度砒霜(纳米乳)的培养基3ml/瓶,每组3个复瓶。48h后终止培养,消化并收集细胞,PBS洗2次,70%冷乙醇固定30min。PBS洗涤2次后加入Rnase酶消化10min,1500r/min离心5min,弃上清液,PBS重悬后加碘化丙锭(终浓度20μg/ml)染色15min,流式细胞