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时间:2019-03-20
《小鼠lewis肺癌靶向性免疫基因治疗的实验研究》由会员上传分享,免费在线阅读,更多相关内容在学术论文-天天文库。
1、中巧分类号73-36+2:RSKIHUANMEDITYICALUNIVERS硕±学位论文W小鼠Lewis巧癌巧向巧免疫基因治巧的实验研巧院(系)、巧临床医学院研妃半_姓《刘窩华学科、专业外科学見肺巧免唐小至副教挖'■二〇—五年四月目录小鼠Lewis肺癌鞭向性免疫基因治疗的实验研究1中文摘要1英文摘要4前B8一第部分小鼠TERT启动子(mTER巧)的克隆及其在肺癌中转录活性的检测11小鼠TE民T启动子(mTERT)的克隆及鉴定
2、11p实验材料及主要实验仪器11实验方法12实验结果16mTERT后动子在不同细胞中转录活性的检19实验材料及主要实验仪器19实验方法20实验结果22扣结23■?.1第二部分结核杆菌抗原Ag85A-Ag85B基因表达慢病毒质粒构建及病毒包装24慢病毒质粒构建24实验材料及主要实验仪器24实验方法25实验结果29慢病毒包装、感染及目的基因表达的检测36实验材料及主要实验仪器36实验方法37实验结果40^41
3、第王部分mTERT启动子调控A85A-A85B双基因慢病毒对小鼠ggLewis肺癌的杀伤的体内实验43实验材料及主要实验仪器43实验方&44实验结果46小结50讨论51全文结论57参考文献58英没缩略词对照表66致谢67NSCLC的免疫治疗68四川医科大学硕±学位论文小鼠Lewis肺癌铅向性免疫基因治巧的实验研究摘要研究背景与目的:肺癌已经成为对人类生命和健康威胁最大的头号癌症杀手,尽管过去的数十年间,手术、放巧和化疗等传统治疗不断取得
4、进展,但目前肺癌的治疗效果仍不理想。免疫基因治疗是近年来肿瘤研究的热点一领域之,也是有望改善目前肺癌治巧现状的新方法而备受期待。引入外源性抗原基因,使肿瘤细胞表达外源性抗原,激活宿主的主动免疫,是免疫基因治疗的重要策略。多项研究展示了送种方法的可行性。然而,机体的免疫机制十分复杂,过度或广泛的免疫反应将导致严重的免疫相关性疾病。因此,肿瘤免疫基因治疗理想结果应该是治疗效应具有高度肿瘤祀向。性,即免疫反应局限在肿瘤局部用肿瘤特异性启动子对目的基因的表达一进行转录调控是靴向性基因治疗的基本方法之。端
5、粒酶催化亚单位QelomerasecatalticsubunitTE民T)启动子的转录活性具有肿瘤特异性y,高,适用范围广泛的特点,成为肿瘤祀向性基因治疗研究中应用最广泛的的基因转录调控元件。本课题旨在探索小鼠TERT启动子作为基因转录调控元件,结核杆菌抗原基因Ag85A和Ag85B为治疗基因的肺癌祀向性免疫基因治疗的可行性和具体途径。方法;1.小鼠基因组DNA为模板,通过PC民方法克隆小鼠端粒酶催化亚单位启动子(mTE民巧)活性片段,并将mTERT启动子插入焚光素酶报GL3-basm巧民
6、T告质粒pic,构建p调控的英光素酶报告质粒GL3-mTE民Tc,然后用LuiferaseAssa检巧!mTERTis月ppyJ在小鼠Lew市癌p1本课题受国家自然科学基金资助(批准号:8172237)和四川省科技厅支撑项目资助(肺癌视向性免疫基巧治疗的实验研究)-1-四川医科大学硕±学位论文细胞、小鼠成纤维细胞N阻3T3、人肺腺癌细胞株A549、人食管癌细胞株EC-109M艮C-5中2和正常人化肺成纤维细的转录活性;.化学合成结核杆---85A和A85B85AMYCP2A-
7、A85BHA菌抗原Agg双基因序列Agg,其中Mc和HA为柄签序列,便于后续实验中对A85A和A85B蛋白表达进ygg行检测;P2A为口蹄疫病毒连接序列,将Ag85A和Ag85B连接起来,构一----建到同载体中,各自独立表达。将Ag85AMYCP2AAg85BHA序列克--LVX-EGFP3FLAGPuro中隆到慢病毒质粒P,构建成CMV启动子驱动的A85A-A85B慢病毒表达质粒LVX-A85A-A85B-CMVggpgg;利用核酸分子克隆技术用mTERTp取代pLVX-Ag85A-Ag85B-C
8、MV中的CMV启动mTE民T-子,构建p驱动的Ag85AAg85B双基因慢病毒质粒LVX-85A--A85B-mTE民T85A-ApAgMYCgp;3.用构建的两种Agg85B慢病毒质粒分别包装慢病毒,感染Lewis肺癌细胞和小鼠成纤维细胞N阳3T3,用
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