fhit基因转染对肝癌细胞系hepg2的作用

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1、FHIT基因转染对肝癌细胞系HepG2的作用【关键词】肝癌RoleoftransfectionofFHITgeneinhumanhepatocellularcarcinomacelllineHepG2　　【Abstract】AIM:TostudytheroleoftransfectionofFHITgeneintoahumanlivercancercelllineHepG2.METHODS:FHITgeneanlivercancercelllineHepG2bylipofectamine.Afterselectionmunochemistryand).Themorphologic

2、alchangesicroscope.RESULTS:StableexpressionofFHITprotEinintransfectedHepG2cellsissionelectronmicroscopeandfloetryshoSphasetoG2phase.CONCLUSION:TheresultsindicatethatFHITgenecaninhibitthegroa　　【摘要】目的：探讨外源性FHIT基因的表达对肝癌细胞株HepG2的影响.方法：用脂质体介导法将pcDNA3.1FHIT及空载体pcDNA3.1(+)导入肝癌细胞系HepG2中，G418选择培养，经免疫组

3、化和EM培养液中，CO2孵箱，37℃培养，当细胞处于对数生长期的时候收获细胞.将细胞爬片用10mmol/LPBS洗2min×2，丙酮固定20min.10mmol/LPBS洗4min×2，作细胞爬片HE染色.取对数生长期的3组细胞，接种于100mL培养瓶中.待细胞铺满瓶底的80%时，胰蛋白酶消化，10mmol/LPBS洗涤，收集细胞于Ep管内，40g/L戊二醛4℃固定过夜，包埋时用10mmol/LPBS洗3次，每次10min.10g/L锇酸固定4℃,1h，系列丙酮脱水，Epon812树脂包埋，修块，制备超薄切片，铀铅双重染色，透射电镜观察并照相.　　1.2.2细胞生长特性分析取对数

4、生长期的pcDNA3.1FHIT转染组、pcDNA3.1(+)空载体转染组细胞及未转染对照组，用胰蛋白酶消化，制成单细胞悬液.分别接种于24孔培养板，1×104细胞/孔.从接种2d起，每24h用胰蛋白酶消化细胞，用血细胞计数板计数，每个孔计3次，每个时间点每种细胞设4个平行孔，取其平均值.以培养时间为横轴，细胞数为纵轴，绘制细胞的生长曲线.取对数生长期的3组细胞，接种于100mL培养瓶中.待细胞80%铺满时，用2.5g/L胰蛋白酶0.2g/LEDTA液消化，使细胞成为单细胞悬液，10mmol/LPBS洗3次，收集细胞加入4℃预冷的700mL/L乙醇10mmol/LPBS，吹打均匀

5、，4℃固定2h以上.10mmol/LPBS洗涤1次，用含10mL/LTritonX100，0.1g/LRnase酶处理细胞30min.5g/L碘化丙（PropidiumIodide，PI）4℃，20min，过300目尼龙网.上流式细胞仪测定在488nm波长下DNA含量，用Multicycle软件分析细胞周期分布.　　2结果　　转化、扩增、提取及纯化的质粒pcDNA3.1FHIT，经测序证实FHIT序列与GenBank数据库所收录的FHIT序列完全一致.pcDNA3.1FHIT转染组的HepG2细胞在胞质中可见棕黄色染色，pcDNA3.1(+)转染组和未转染对照组的HepG2细胞未

6、见明显染色，提示FHIT蛋白表达于细胞质中（Fig1）.pcDNA3.1FHIT转染组HepG2细胞裂解液通过r17000的蛋白条带（Fig2），未转染对照组和pcDNA3.1(+)转染组中未检测到FHIT蛋白的表达.证实了构建的真核表达载体pcDNA3.1FHIT经转染后可在肝癌细胞HepG2中稳定过表达FHIT蛋白.　　2.1细胞形态学细胞爬片的HE染色经生物显微镜观察，转染FHIT基因组细胞形态与空载体转染组细胞及未转染组细胞均伸展良好，3种细胞均呈多梭A:HepG2cells;B:pcDNA3.1HepG2cells;　　形或多角形，大小不等，可见核分裂像及多个核仁，未见

7、明显变化.透射电镜观察，转染空载体组细胞和未转染组的细胞，细胞超微结构无明显差异，细胞圆形、卵圆形较多，细胞表面微绒毛均较丰富，细胞核大，核质比例大，核的异形性明显，呈肾形、马蹄形，有些凹陷.胞质透亮，染色质分布均匀，每个细胞内可见2～3个核仁.核分裂较多见.与转染空载体组和未转染组的细胞相比，转染FHIT组细胞大小不等，细胞表面的微绒毛减少.核仁明显，核染色质轻度边集，内质网明显扩张，线粒体聚集，细胞质可见较多空泡、溶酶体及糖原（Fig3）.　　2.2细胞生长特性未转染组和空载