外源性fhit基因转染对人胃癌细胞系mkn45迁移和侵袭能力的影响

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1、外源性FHIT基因转染对人胃癌细胞系MKN45迁移和侵袭能力的影响：刘飞，黄培林，黄照权，李楠，徐佳佳，吴鹏【摘要】目的：探讨脆性组氨酸三联体(FHIT)基因转染对人胃癌细胞MKN45迁移和侵袭能力的影响。方法：将载有人外源性FHIT基因的真核表达质粒pcDNA3.1FHIT，转染至FHITmRNA阴性表达的人胃癌细胞MKN45，分别应用Millicell小室细胞迁移实验、Transin2000购自美国Invitrogen公司;其它生化试剂均为分析纯。　　1.2方法　　1.2.1真核表达

2、质粒pcDNA3.1FHIT的转染参照说明书，用Lipofectamine2000将真核表达质粒pcDNA3.1FHIT转染至FHIT基因mRNA阴性表达的人胃癌细胞MKN45。转染后采用G418筛选阳性克隆，并且继续培养。用RTPCR法检测FHITmRNA的表达。　　1.2.2Millicell小室细胞迁移实验检测细胞迁移能力变化(1)趋化因子的制备：用含10%小牛血清的高糖DMEM培养液,培养NIH3T3细胞至饱和度达80%时弃去原培养液，加入不含血清的RPMI1640培养液3～4m

3、l，培养24　h后收集培养液，2000r·min-1离心5～10min，取上清液过滤后-70℃冻存备用。利用饥饿培养的NIH3T3细胞分泌至上清液中的一系列趋化因子，趋化肿瘤细胞向下室运动。(2)分别收集空白对照组(MKN45)、pcDNA3.1空质粒转染组(pcDNA3.1MKN45)和pcDNA3.1FHIT转染组(pcDNA3.1FHITMKN45)细胞各1×105个，用含1%FBS的RPMI1640洗涤细胞3次;将小室置入6孔板，在小室内加入1×105个细胞，在6孔板内加入16

4、00μl趋化液;常规培养8h后取出小室。用95%酒精固定细胞，然后行HE染色。轻轻用棉签擦净小室上室面无侵袭性的细胞，在倒置显微镜下放大200倍计数移至微孔膜下层的细胞数目，每个样本随机选择10个视野计数后取均值。实验重复3次。　　1.2.3Trans。将人工合成的基底膜材料Matrigel胶用同样体积的无血清培养液稀释后，分别取300μg均匀加于每个小室的膜上，十字摇晃使胶平铺在聚碳酸脂膜上。37℃成胶30min。使用前加无血清培养液于小室内37℃放置20min，使Matrigel胶重新水化。

5、(3)接种细胞：细胞分组同迁移实验，将细胞小室放入6孔培养板中，在小室外加入1500μl含趋化因子的条件培养液，在小室内加入800μl细胞悬液(含1×105个细胞)，常规培养24～72h，分别在24、48、72h观察。(4)取出Transin，HE染色。(5)在倒置显微镜下放大200倍计数移至微孔膜下层的细胞数目，每个样本随机选择10个视野计数后取均值。实验重复3次，细胞体外侵袭力以侵入滤膜下层的细胞数来判定。　　1.3统计学处理　　实验结果以x±s表示，采用SPSS11.5统计软件进行单因素方

6、差分析，多重比较采用LSD法，P<0.05为统计学差异显著。统计结果的图形化由Excel2000绘图程序完成。　　2结果　　2.1重组质粒pcDNA3.1FHIT转染MKN45细胞后FHIT基因mRNA的表达情况pcDNA3.1FHIT转染组细胞有462bp大小的目的基因条带出现，而pcDNA3.1空质粒转染组和空白对照组均无目的条带出现(图1)。　　2.3FHIT基因转染对MKN45细胞侵袭能力的影响　　Transarini等[7]在研究p53缺失引起的以微管为靶位化疗药抵抗中发

7、现伴有FHIT表达量的相应改变，表明FHIT可能通过影响微管的组装来发挥其抑制肿瘤的作用。因此，FHIT基因及所表达的蛋白作为微管相关蛋白可能参与影响微管的组装，从而影响迁移的发生，其具体机制有待以后进一步的实验证实。　　本实验在Transinogenactivator,uPA)，后者主要降解其中的糖蛋白及蛋白聚糖中的多糖链。参与破坏细胞外基质的酶类具有不同程度的特异性，MMP是主要的直接作用者，它通过对细胞外基质中不同成分的降解，在肿瘤侵袭转移中起关键性作用。胃癌研究中发现MMP高表达与胃癌的

8、发生、侵袭和转移有关。本实验上室中的细胞穿越膜上滤膜的下表面，其数量的多少反映了该细胞侵袭能力。侵袭实验结果提示，FHIT基因的表达水平与MKN45细胞的侵袭力改变无明显相关性。　　肿瘤侵袭和转移是多阶段、多基因参与的过程，相关基因的调节机制异常复杂，涉及多条信号转导途径，阻断其表达或其介导的信号转导通路将有可能为抗肿瘤治疗提供一些较为理想的思路。【参考文献】　[1]CANTORJP,ILIOPOULOSSD,RAOAS,etal.Epigeicmodulationofendogenoustu