斑马鱼ｓａａ蛋白原核表达、抗体制备及菌结合研究

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1、斑马鱼ＳＡＡ蛋白原核表达、抗体制备及菌结合研究齐麟１，李军２，向志明３，余英才４（１．铁道警察学院，郑州４５００５３；２．聊城大学药学院，山东聊城２５２０００；３．中国科学院南海海洋研究所，广州５１０３０１；４．江西中医药大学生物化学教研室，南昌３３０００４）摘要：通过构建斑马鱼（Ｄａｎｉｏｒｅｒｉｏ）ＳＡＡ原核表达载体，在大肠杆菌（E.coli）ＴＢ１中诱导表达并纯化获得了斑马鱼ＳＡＡ融合蛋白，将纯化的斑马鱼ＳＡＡ蛋白免疫Ｂａｌｂ／ｃ小鼠，制备了特异性多克隆抗血清，并研究了斑马鱼ＳＡＡ融合蛋白与细菌的结合能力及检测了抗体效价。结

2、果表明，纯化的斑马鱼融合ＳＡＡ蛋白能够与５种细菌直接结合，血清效价达到１∶２０００以上。.jyqkal-c2x-SAA的构建使用Ｐｒｉｍｅｒｐｒｅｍｉｅｒ５．０软件设计上、下游引物，以ｐＧＥＭ－Ｔ－ＳＡＡ为模板进行ＰＣＲ扩增，其中上游引物序列：５′－ＴＴＴＧＡＡＴＴＣＡＴＧＡＡＧＣＴＴＣＴＴＣＴＴＧ－３′，下游引物序列：５′－ＴＴＴＴＣＴＡＧＡＴＡＴＧＧＧＣＡＧＧＣＣＴＴＴＡ－３′。ＰＣＲ反应程序为：９４℃预变性５ｍｉｎ；９４℃变性２０ｓ，５６℃退火３０ｓ，７２℃延伸３０ｓ，共３０个循环；７２℃延伸１０ｍｉｎ。将ＰＣＲ扩增产物经琼

3、脂糖凝胶回收试剂盒回收纯化后和ｐＭａｌ－ｃ２ｘ空载体质粒进行ＥｃｏＲⅠ和ＸｂａⅠ双酶切，酶切产物经琼脂糖凝胶电泳回收纯化后于１６℃连接过夜，并将连接产物转化原核表达宿主菌ＴＢ１，－８０℃保菌。１．３重组质粒ｐＭａｌ－ｃ２ｘ－ＳＡＡ的诱导表达及纯化取“１．２”中的菌液０．５ｍＬ接种到５ｍＬ含氨苄青霉素的新鲜ＬＢ液体培养基中，３７℃过夜培养后，转接到５００ｍＬ的新鲜培养基中，继续３７℃培养至ＯＤ６００ｎｍ＝０．６，加入０．１ｍｍｏｌ／Ｌ的ＩＰＴＧ诱导３ｈ以上，以１２％的ＳＤＳ－ＰＡＧＥ电泳分析其表达后利用ＡｍｙｌｏｓｅＲｅｓｉｎ多糖树

4、脂来纯化重组蛋白。１．４斑马鱼ＳＡＡ蛋白的菌结合试验将获得的斑马鱼ＳＡＡ纯化蛋白用于细菌结合试验，具体操作见文献［１０］。１．５斑马鱼ＳＡＡ蛋白抗鼠血清制备取１００μｇ纯化的斑马鱼ＳＡＡ融合蛋白进行ＳＤＳ－ＰＡＧＥ，切下目的蛋白质条带，以去离子水反复漂洗，去除凝胶上的甲醇和冰醋酸，以ｐＨ７．４的ＰＢＳ缓冲液４℃浸泡过夜。于冰浴中用研钵研磨直至悬浮液中的凝胶颗粒细小而均匀，加入等体积的弗氏佐剂，继续研磨或用注射器反复抽打使完全乳化。将１ｍＬ用弗氏完全佐剂乳化的抗原溶液通过腹腔注射接种发育良好的纯种Ｂａｌｂ／ｃ小鼠体内做为基础免疫，基

5、础免疫后１４ｄ进行加强免疫。注射间隔周期为７ｄ，加强注射所用的抗原溶液用弗氏不完全佐剂进行乳化。加强免疫４次后采用传统摘除眼球取血法采集Blab/c小鼠血液。取出的血液３７℃保温１ｈ后，４℃静置过夜，５０００ｒ／ｍｉｎ离心１０ｍｉｎ后，取上清－８０℃分装保存。１．６斑马鱼ＳＡＡ蛋白抗鼠血清效价的测定用ＰＢＳ缓冲液将抗鼠血清进行稀释，稀释梯度依次为１∶１００、１∶２００、１∶５００、１∶１０００、１∶２０００、１∶３０００。取ＮＣ膜用ＰＢＳＴ缓冲液浸泡５ｍｉｎ，晾干，取纯化的蛋白１μｇ点于膜上，用含５％脱脂奶粉的ＰＢＳＴ缓冲液３７℃

6、封闭１ｈ，ＰＢＳＴ缓冲液洗涤１０ｍｉｎ（重复３次）；将膜分别用封闭液稀释的抗血清３７℃孵育１ｈ，ＰＢＳＴ缓冲液洗涤１０ｍｉｎ（重复３次）；用羊抗鼠ＩｇＧ为二抗，３７℃哺育１ｈ，ＰＢＳ缓冲液洗涤１０ｍｉｎ（重复３次），ＤＡＢ显色。２结果与分析２．１原核表达载体ｐＭａｌ－ｃ２ｘ－ＳＡＡ的构建使用载体构建的特异性引物进行菌落ＰＣＲ扩增，对ＰＣＲ扩增产物进行１．２％琼脂糖凝胶电泳检测，结果如图１所示。由图１可以看出，挑选的５个克隆中有４个大小约３６０ｂｐ，与预期大小相符，表明成功构建ｐＭａｌ－ｃ２ｘ－ＳＡＡ原核表达载体。２．２ＳＡＡ蛋白的

7、表达与纯化将融合表达载体ｐＭａｌ－ｃ２ｘ－ＳＡＡ质粒转化到Ｅ．ｃｏｌｉ菌株ＴＢ１，用０．１ｍｍｏｌ／Ｌ的ＩＰＴＧ３７℃分别诱导３、６ｈ后，菌体用１２％的ＳＤＳ－ＰＡＧＥ电泳分析，结果如图２所示。由图２可以看出，在５３ｋｕ附近有明显的蛋白条带出现，与预期大小相同，并利用ＡｍｙｌｏｓｅＲｅｓｉｎ多糖树脂来纯化了重组蛋白，获得较为专一的蛋白条带。２．３斑马鱼ＳＡＡ蛋白菌结合试验结果使用纯化的ＳＡＡ融合蛋白与３种革兰氏阴性菌（野生型大肠杆菌Ｋ１２、副溶血弧菌、溶澡酸弧菌）以及２种革兰氏阳性菌（金黄色葡萄球菌和表皮葡萄球菌）分别进行结合试验

8、，以诱导ｐＭａｌ－ｃ２ｘ空载体获得的融合蛋白为对照，结果如图３所示。斑马鱼ＳＡＡ具有广谱的菌结合能力，与上述５种细菌都能结合。２．４斑马鱼ＳＡＡ抗小鼠多克隆抗体效价的测定结果取纯化后的重组斑马鱼ＳＡＡ蛋白对小鼠进行皮下免疫，经过４次免疫后，从兔子耳