cpg odn通过活化p38 mapk上调a549细胞β防御素2的表达

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1、CpGODN通过活化p38MAPK上调A549细胞β防御素2的表达作者：李明，陈伟强，李岩，罗少洪，简玲敏【摘要】目的研究含CpG基序的寡核苷酸(unmethylatedCpGmotifcontaining　oligodeoxynucleotide，CpGODN)对人肺腺上皮细胞A549β防御素2(humanβdefensin2,hBD2)的表达及p38MAPK磷酸化水平的影响。方法培养A549细胞，加或不加p38特异性抑制剂SB203580情况下用不同浓度CpGODN进行干预。用RTPCR法检测刺激后A549细胞hBD2mRNA表达变化，用APK蛋白磷酸化水平的变化。结

2、果CpGODN刺激可以促进A549细胞内磷酸化p38MAPK含量的增加，活化p38MAPK途径，从而诱导hBD2的表达，与对照组比较,P<0.05;用特异性阻断剂SB203580阻断p38MAPK磷酸化可抑制CpGODN的诱导作用。结论CpGODN通过p38MAPK途径诱导hBD2在呼吸道上皮细胞的表达，增强呼吸道对外界微生物的抵抗作用。【关键词】CpGODN;β防御素2;肺腺上皮细胞;p38MAPK　Abstract:ObjectiveToinvestigatetheeffectsofunmethylatedCpGmotifcontaining　oligodeoxynu

3、cleotide(CpGODN)ontheexpressionofhumanβdefensin2(hBD2)andthephosphorylationofp38MAPKinlungepithelialcelllineA549.MethodsA549cellsulatedRNAexpressionofhBD2inedbyRTPCRandthephosphorylationlevelofp38MAPKarkedlyupregulated.CpGODNinducedhBD2expressionighteffectivelyupregulatehBD2expressioni

4、nlungepithelialcellsthroughp38MAPKpathanβdefensin2;lungepithelialcells;p38MAPK　　目前认为，呼吸道上皮细胞不仅是物理性的防御屏障，还可以合成和分泌包括抗菌肽在内的多种细胞因子，在气道的炎症反应、免疫调节等方面发挥重要作用。β防御素2(humanβdefensin2,hBD2)是呼吸道上皮细胞在细菌和炎症因子诱导下所分泌的主要抗菌肽分子，不仅具有抗菌、抗病毒等生物学活性，还可以激活获得性免疫系统，在呼吸系统抵抗外界致病微生物感染中起重要作用[1]。如果能增强呼吸道hBD2的表达，对于防治呼吸系统的感

5、染性疾病和应对日益严重的细菌耐药具有重要意义。细菌DNA与真核细胞不同，其含有大量的以非甲基化胞嘧啶鸟嘌呤二核苷酸(cytosinephosphateguanosine，CpG)为核心的特定序列(即CpG基序)，因此可被真核细胞通过TLR9识别，最终激活NFκB、p38MAPK等信号分子启动免疫应答[2,3]。目前人工合成的含CpG基序的寡核苷酸序列(unmethylatedCpGmotifcontaining　oligodeoxynucleotide，CpGODN)已成为一种具有非特异性免疫刺激能力的免疫佐剂，能有效诱导T、B淋巴细胞活化和抗原提呈细胞成熟，增强机体免疫反应。

6、本研究用CpGODN刺激肺腺上皮细胞A549，观察其对hBD2表达的影响，并从p38MAPK信号途径出发探讨其作用机制，探索CpGODN作为免疫佐剂对呼吸道天然免疫分子hBD2的诱导作用。　　1材料　　1.1主要试剂CpGODN1826、引物(大连Takara公司);两步法RTPCR试剂盒、Trizol(美国Invitrogen公司);SB203580(美国Sigma公司);蛋白提取试剂盒、ECL化学发光试剂盒(美国Pierce公司);抗p38MAPK、磷酸化p38MAPK抗体(美国SantaCruze公司)。　　1.2主要仪器PCR仪(美国Perkinelmer公司);紫外凝

7、胶成像系统、蛋白电泳仪、电转仪、杂交箱(美国BioRad公司)。　　2方法　　2.1细胞培养及干预实验人肺腺上皮细胞A549为本室保存，用完全DMEM培养基传代培养。生长状态良好的A549细胞经0.25%(φ)胰酶消化后，调整细胞浓度为5×105/mL，1mL每孔接种到6孔培养板内，待细胞生长至80%融合后，用PBS清洗2次，更换培养液，加入不同浓度的CpGODN[4](碱基序列为5′TCCATGACGTTCCTGACGTT3′，所有碱基均经硫代磷酸