cd4+cd25+调节性t细胞在肝移植术后腹腔感染中的表达及其作用

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1、CD4+CD25+调节性T细胞在肝移植术后腹腔感染中的表达及其作用【摘要】目的研究移植后细菌感染CD4+CD25+调节性T细胞(Treg)表达的变化。方法以DA大鼠为供体，LEethodsOrthotopiclivertransplant(OLT,DAtoLeodelsodifiedKamadatlydividedinto3groupsafteroperation.Normalsalineinalcavityat3rddaypostoperativelyingroup1,mixedBacilluscoliliquidingro

2、up2andCsAat3mg/kgperdayingroup3.SixrecipientsplesRNAinliversetryandRTPCR,respectively.ResultsparedRNA.AlthoughtheserumconcentrationsofASTandTB7dinGroup2inalcavitybacterialinfectionafterlivertransplantationinratsincreaseexpressionofTreg,promotetheimmunosuppressiveac

3、tionandpartiallyalleviatetheacuterejection.【Keyinalcavitybacterialinfection;CD4+CD25+regulatoryTcells;Acuterejection肝移植已成为终末期肝病及急性肝功能衰竭的有效治疗方法，然而术后创伤及大量激素和免疫抑制药物的应用又会增加细菌、病毒、真菌的感染，这也是肝移植术后引起死亡的常见原因之一［1-2］。在重症感染时机体的免疫系统在经历免疫激活后会进入免疫抑制状态，以防止组织器官的过度病理损害，其中CD4+CD25+免疫抑制

4、性细胞发挥了重要作用［3］。移植后由于创伤及免疫抑制药物的应用，机体处于免疫受损状态，此时合并细菌感染的机体免疫状态会发生怎样的变化，CD4+CD25+调节性T细胞(Treg)表达水平如何，对肝功及免疫排斥会有怎样的影响?本研究旨在探明上述问题。1材料与方法1.1材料成年雄性近交系DA大鼠(体质量200g左右)为供体，购于哈尔滨医科大学动物中心。以成年雄性近交系Leada二袖套法［4］，无需静脉分流，建立大鼠肝移植模型。随机分为(1)免疫排斥组(G1)：大鼠肝移植术后3d腹腔内生理盐水注射；(2)移植术后感染组(G2)：于移植

5、术后3d腹腔内大肠杆菌注射，注射量为5×105CFU/ml；(3)免疫抑制组(G3)：移植术后CsA肌注，注射量3mg/(kg·d)。感染后7d每组随机处死动物6只，取血及肝脏、脾脏，备相应指标及病理学检测。1.2.2检测指标及实验方法(1)脾脏CD4+CD25+细胞亚群检测：处死大鼠，无菌取脾，用EZSepTMMouseIX淋巴细胞分离液分离出淋巴细胞，细胞计数，调整细胞浓度为1×106/ml。取上述淋巴细胞混悬液50μl，加入标有荧光素的单克隆抗体工作液50μl(每种抗体各25μl)；37℃水浴30min，避光；加入PB

6、S10m1，混匀；1000r/min离心10min；重复离心1次；加入1mlPBS缓冲液混匀；上机检测。(2)脾脏Foxp3mRNA的表达：用Trizol液提取100mg脾组织mRNA，分光光度法测定RNA的纯度，采用RTPCR技术，以G3PDH为内参，引物序列Foxp3：Sense5′CCCAGGAAAGACAGCAACCTT3′，Antisense5′CTGCTTGGCAGTGCTTGAGAA3′，扩增产物片段长度为619bp；G3PDH：Sense5′GCATGGCCTTCCGTGTTCCTAC3′，Ant

7、isense5′ACTCCTTGGAGGCCATGTAGGC3′，扩增产物片段长度为318bp。PCR反应参数：预变性94℃5min，PCR反应94℃30s、57℃30s、72℃1min，35个循环，延伸72℃10min。用凝胶成像系统照相，Bandscan软件进行图像分析，结果以目的区带的光密度值积分/内参区带的光密度值积分表示，作为目的mRNA的相对含量，进行半定量分析。(3)肝脏内IL10、TGFβmRNA的表达：RNA提取同上述，仍以G3PDH为内参。引物序列IL10：Sense5′GCTGACAGATTC

8、CTTACTGCAGG3′，Antisense5′ACGTAGGCTTCTATGCAGTTGATG3′，片段长度为321bp；TGFβ：Sense5′CACCTGCACAGCTCCAGGCAC3′，Antisense5′CTTGCGACCCACGTAGTAG