大黄虫丸经旁分泌途径对早期肝纤维化的干预作用

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1、大黄虫丸经旁分泌途径对早期肝纤维化的干预作用作者：成家茂，潘志恒，谢瑶，何宏文，曲怀刚【摘要】　　目的观察大黄虫丸经旁分泌途径对大鼠肝星状细胞增殖及其表达TGF-β1基因的影响。　方法采用Nycodenz分离液非连续密度梯度离心法同步分离急性CCl4损伤模型大鼠和正常大鼠肝的枯否细胞（KC）和星状细胞（HSC）。在制备正常鼠血清和大黄虫丸药物血清的基础上，将它们分别加入KC培养板内作用48h后制备成正常鼠KC条件培养液（NKCCM）和损伤鼠KC条件培养液（KCCM）。将NKCCM和KCCM作用于活化的HSC24h后，采用MTT法和3H-TdR掺入法检测HSC增殖的变化；采用半定量RT-PCR

2、法扩增TGF-β1mRNA以检测HSC表达TGF-β1基因的情况。　结果旁分泌组各组的HSC增殖幅度及TGF-β1基因的相对表达量较正常对照组NKCCM组均明显增加（P＜0.05或0.01）。同时旁分泌组中，含药血清作用的5%，10%和20%KCCM组较无药物血清作用的0%KCCM组HSC的增殖能力及TGF-β1基因的相对表达量则下降，且随药物浓度的升高逐渐降低，其组间差别有统计学意义（P＜0.05或P＜0.01）。结论大黄虫丸可明显抑制经旁分泌途径活化的大鼠HSC的增殖及TGF-β1基因的表达，且其抗肝纤维化效应与药物剂量间存在一定的依赖关系。【关键词】大黄虫丸　肝纤维化　肝星状细胞　旁分

3、泌　　Abstract：ObjectiveToobservetheeffectsofDahuangZhechongPillontheproliferationofrathepaticstellatecells(HSCs)activatedbyparacrinepathinggroalratKupffercells(KCs),hepaticstellatecellsedium.Afterthemonratandthedrugseraprepared,theyalKupffercellsconditionedmedium(NKCCM)andinjuredratKupffercellscondit

4、ionedmedium(KCCM)after48h.TTand3H-thymidine(3H-TdR)incorporationassay,andtheexpressionofTGF-β1geneinHSCsbysemi-quantitativeRT-PCRedium.ResultsInallparacrinegroups,themultiplicationofHSCsandtherelativeexpressionofTGF-β1genearkedlyparedtonormalcontrolgroup(P＜0.05orP＜0.01),andgraduallydecreasedinalldr

5、ugandnodrugserumgroupsongallgroups.ConclusionDahuangZhechongPillcanobviouslyinhibittheproliferationofratHSCsactivatedbyparacrinepathanner.　　Keyinggroa公司；四氯化碳（CCl4）、高纯度琼脂糖、核酸染料等生化试剂购自上海生物工程有限公司；M199培养液（标准型）、DMEM干粉均购自Invitrogen公司产品；标准胎牛血清（fetalbovineserum，FBS）购自杭州四季青生物制品公司；总RNA提取试剂（RNAisoReagent）、RT-

6、PCR试剂盒（TaKaRaRNAPCRKit(AMV)Ver.3.0）及100bpDNAMarkers均购自宝生物工程（大连）有限公司；引物由上海英骏生物技术有限公司合成；氚-胸腺嘧啶核苷（3H-TdR）购自中国科学院上海原子核研究所等。OLYMPUSCX31型倒置相差显微镜（OLYMPUS公司）；HeraeusBiofuge15R型台式高速冷冻离心机（德国Heraeus公司）；HeraeusBB16型CO2恒温培养箱（德国Heraeus公司）；SDJ-SP三相单人水平层流洁净工作台（上海淀山湖净化厂）；FJ-211G双道液体闪烁仪（西安二六二厂产品）；Bio-TekEL×800型全自动酶标

7、仪（美国Bio-Tek公司产品）；POJPTC-100TM型PCR仪（美国MJRearch公司产品）；BIO-MATE5型紫外可见光分光光度计（BIO-MATE日本公司生产）等。　　2方法　　2.1含药血清及正常鼠血清的制备参考　　3结果　　3.1条件培养液对活化HSC增殖的影响旁分泌组和正常对照组CM对活化的HSC作用24h后，MTT法检测各组的OD值为：NKCCM（0.375±0.056）、0%KCCM（