大黄虫丸预防dmn诱导大鼠肝纤维化的作用及其机制研究

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1、大黄虫丸预防DMN诱导大鼠肝纤维化的作用及其机制研究【摘要】观察大黄虫丸预防大鼠肝纤维化的作用。［方法］二甲基亚硝胺诱导大鼠肝纤维化模型，同时用大黄虫丸进行预防，观察其对大鼠血清ALT、AST，肝组织的纤维化程度、血管紧张素Ⅱ1型受体（AT1R）及其mRNA的表达、以及血管紧张素转化酶mRNA表达的影响。［结果］大黄虫丸可降低大鼠血清ALT、AST水平，减轻肝纤维化程度，降低大鼠肝组织AT1R及其mRNA表达。［结论］大黄虫丸能部分抑制大鼠肝纤维化时肝组织AT1R及其mRNA的过度表达。【关键词】大黄虫丸；肝纤维化；血管紧张素Ⅱ1型受体；二甲基亚硝胺；大鼠F

2、undproject：ItemsupportedbyZhejiangProvincialEducationalBureau（No：20071096）大黄虫丸系《金匮要略》治疗干血劳的名方，抗肝纤维化疗效确切［1］，但其抗肝纤维化作用机制是否与肝局部RAS相关未见报道。本研究采用二甲基亚硝胺（DMN）诱导大鼠肝纤维化模型，运用大黄虫丸进行预防，以观察其对肝组织AT1R的影响，同时观察其对肝组织AT1R与ACEmRNA表达的影响，从肝局部RAS角度初步探讨大黄虫丸抗肝纤维化的作用机制。　　1实验材料9　　1.1实验动物　　清洁级SD大鼠60只，雄性，体重（160

3、±20）g，浙江中医药大学实验动物中心提供。　　1.2药品与试剂　　大黄虫丸购自湖南回春堂药业有限公司；复方鳖甲软肝片购自内蒙古福瑞中蒙药科技股份有限公司；二甲基亚硝胺购自天津市化学试剂公司。谷丙转氨酶（ALT）、谷草转氨酶（AST）试剂盒均购自上海科欣生物技术研究所；Trizol试剂购自美国Invitrogen公司；AT1R免疫组化试剂盒和DAB显色剂试剂盒购自河北博海生物工程开发有限公司；RT-PCR试剂盒购自上海科延生物技术有限公司。　　1.3实验仪器　　组织切片机（德国Leca公司），恒温水浴箱（江苏太仓医用仪器厂），PCR循环仪（德国Biometr

4、a公司），多功能真彩色细胞图象分析管理系统（美国MediaCybernetics公司），GIS凝胶图像分析处理系统（上海天能科技有限公司），电泳仪（北京市六一仪器厂）。9　　2方法　　2.1造模及分组　　将大鼠随机分为6组，每组10只，分别为正常对照组，模型组，大黄虫丸低剂量组，大黄虫丸中剂量组，大黄虫丸高剂量组（分别简称低、中、高剂量组），复方鳖甲软肝片阳性对照组（简称阳性对照组）。除正常对照组大鼠外，其余50只大鼠按10mg/kg体重腹腔注射1%浓度的DMN生理盐水溶液进行造模，每周连续3d，共4周12次。　　2.2实验用药　　将大黄虫丸与复方鳖甲软肝片

5、分别用蒸馏水溶解制成混悬液，按人与大鼠体表面积比折算的等效剂量给药。造模同时即开始给药预防。大黄虫丸低、中、高剂量组分别按0.54g/kg、1.08g/kg、2.16g/kg体重灌胃给药，复方鳖软肝片按1g/kg体重灌胃给药。模型组与正常组按蒸馏水10ml/kg体重灌胃，各组均每天灌胃1次，连续给药4周至造模结束。　　2.3大鼠处理方法9　　末次给药当晚禁食不禁水，次日上午空腹按40mg/kg剂量腹腔注射1%的戊巴比妥麻醉，腹腔静脉采血，离心机分离取血清，-20℃冰箱保存备用。迅速分离肝脏，取大鼠肝左叶肝组织入4%多聚甲醛磷酸盐缓冲液固定，逐级酒精脱水，经透

6、明、常规石蜡包埋，用作肝组织HE染色、苦味酸-天狼红胶原染色及免疫组织化学染色指标的检测。其余新鲜肝脏经生理盐水清洗后立即投入液氮中冻存，3小时后移入-80℃低温冰箱中保存，用于提取总RNA。　　2.4引物设计与合成　　从GeneBank数据库中获得大鼠基因AT1R、ACEmRNA全序列，以及内参β—肌动蛋白（β-actin）mRNA序列，利用primer5.0引物设计软件设计出上、下游特异性引物。大鼠AT1R引物序列：上游引物为5’-CACGCTTTCTTACCG-3’，下游引物为5’-TGACTACAGGGACAACA-3’；ACE引物序列：上游引物为5

7、’-CGTGGAGGAGTATGACC-3’，下游引物为5’-CAGAGTAGCCGTTGAGC-3’；β-actin引物序列：上游引物为5’-ATGCCATCCTGCGTCTG-3’，下游引物为5’-GGACTCATCGTACTCCTGCT-3’。引物由上海博尚生物科技有限公司合成。　　2.5观察指标及检测方法　　血清ALT、AST采用赖氏法检测，按试剂盒说明书步骤操作。肝组织行HE和苦味酸—天狼红染色，光镜下观察肝组织病理变化与肝纤维化程度，依照实验动物肝纤维化组织学Ⅵ9级标准和改良的Chevallier肝纤维化SSS半定量计分标准进行肝纤维化程度评判［

8、23］。肝组织AT1R的表达按链霉菌抗生物素蛋白-