大黄虫丸预防dmn诱导大鼠肝纤维化的作用及其机制研究.doc

《大黄虫丸预防dmn诱导大鼠肝纤维化的作用及其机制研究.doc》由会员上传分享，免费在线阅读，更多相关内容在工程资料-天天文库。

1、大黄虫丸预防DMN诱导大鼠肝纤维化的作用及其机制研宄【摘要】观察大黄虫丸预防大鼠肝纤维化的作用。［方法］二甲基亚硝胺诱导大鼠肝纤维化模型，同时用大黄虫丸进行预防，观察其对大鼠血清ALT、AST,肝组织的纤维化程度、血管紧张素III型受体及其mRNA的表迗、以及血管紧张素转化酶mRNA表达的影响。［结果］大黄虫丸可降低大鼠血清ALT、AST水平，减轻肝纤维化程度，降低大鼠肝组织AT1R及其mRNA表达。［结论］大黄虫丸能部分抑制大鼠肝纤维化时肝组织AT1R及其mRNA的过度表达。【关键词】大黄虫丸；肝纤维化；血管紧张素III型受体；二甲基亚硝胺；大鼠Fun

2、dproject:ItemsupportedbyZhejiangProvincialEducationalBureau大黄虫丸系《金匮要略》治疗干血劳的名方，抗肝纤维化疗效确切［1］，但其抗肝纤维化作用机制是否与肝局部RAS相关未见报道。本研究采用二甲基亚硝胺诱导大鼠肝纤维化模型，运用大黄虫丸进行预防，以观察其对肝组织AT1R的影响，同时观察其对肝组织AT1R与ACEmRNA表迗的影响，从肝局部RAS角度初步探讨大黄虫丸抗肝纤维化的作用机制。1实验材料实验动物清洁级SD大鼠60只，雄性，体重g，浙江中医药大学实验动物中心提供。药品与试剂大黄虫丸购自湖南回

3、春堂药业有限公司；复方鳖甲软肝片购自内蒙古福瑞中蒙药科技股份有限公司；二甲基亚硝胺购自天津市化学试剂公司。谷丙转氨酶、谷草转氨酶试剂盒均购自上海科欣生物技术研究所；Trizol试剂购自美国Invitrogen公司；AT1R免疫组化试剂盒和DAB显色剂试剂盒购自河北博海生物工程开发有限公司；RT-PCR试剂盒购自上海科延生物技术有限公司。实验仪器组织切片机，恒温水浴箱，PCR循环仪，多功能真彩色细胞图象分析管理系统，GIS凝胶图像分析处理系统，电泳仪。2方法造模及分组将大鼠随机分为6组，每组10只，分别为正常对照组，模型组，大黄虫丸低剂量组，大黄虫丸中剂量

4、组，大黄虫丸高剂量组，复方鳖甲软肝片阳性对照组。除正常对照组大鼠外，其余50只大鼠按10mg/kg体重腹腔注射1%浓度的丽N生理盐水溶液进行造模，每周连续3d，共4周12次。实验用药将大黄虫丸与复方鳖甲软肝片分别用蒸馏水溶解制成混悬液，按人与大鼠体表面积比折算的等效剂量给药。造模同时即开始给药预防。大黄虫丸低、中、高剂量组分别按/kg、/kg、/kg体重灌胃给药，复方鳖软肝片按1g/kg体重灌胃给药。模型组与正常组按蒸馏水10ml/kg体重灌胃，各组均每天灌胃1次，连续给药4周至造模结束。大鼠处理方法末次给药当晚禁食不禁水，次日上午空腹按40mg/kg剂

5、量腹腔注射1%的戊巴比妥麻醉，腹腔静脉采血，离心机分离取血清，-20°C冰箱保存备用。迅速分离肝脏，取大鼠肝左叶肝组织入4%多聚甲醛磷酸盐缓冲液固定，逐级酒精脱水，经透明、常规石蜡包埋，用作肝组织HE染色、苦味酸-天狼红胶原染色及免疫组织化学染色指标的检测。其余新鲜肝脏经生理盐水清洗后立即投入液氮中冻存，3小时后移入_80°C低温冰箱中保存，用于提取总RNA。引物设计与合成从GeneBank数据库中获得大鼠基因AT1R、ACEmRNA全序列，以及内参0—肌动蛋白mRNA序列，利用引物设计软件设计出上、下游特异性引物。大鼠AT1R引物序列：上游引物为5’-

6、CACGCTTTCTTACCG-3’，下游引物为5’-TGACTACAGGGACAACA-3’；ACE引物序列：上游引物为5’-CGTGGAGGAGTATGACC-3’，下游引物为5’-CAGAGTAGCCGTTGAGC-3’；3-actin引物序列：上游引物为5’-ATGCCATCCTGCGTCTG-3’，下游引物为5’-GGACTCATCGTACTCCTGCT-3’。引物由上海博尚生物科技有限公司合成。观察指标及检测方法血清ALT、AST采用赖氏法检测，按试剂盒说明书步骤操作。肝组织行HE和苦味酸一天狼红染色，光镜下观察肝组织病理变化与肝纤维化程度，

7、依照实验动物肝纤维化组织学VI级标准和改良的Chevallier肝纤维化SSS半定量计分标准进行肝纤维化程度评判［23］。肝组织AT1R的表迗按链霉菌抗生物素蛋白-过氧化物酶连接法免疫组化试剂盒说明书检测。运用美国MediaCybernetics公司ImageProPlus多功能真彩高清晰度彩色病理图文分析系统对AT1R阳性细胞进行分析。逆转录一聚合酶链反应法检测肝组织AT1R与ACEmRNA的表达：用Trizol一步法抽提肝组织总RNA。逆转录后使用上述引物进行PCR扩增。PCR反应体系为50u1。扩增条件均为：94°C预变性2min；94°C变性30

8、s，50°C退火45s，72°C延伸45s，35个循环；72°(3延伸10111