枳根特异性contig2基因及启动子克隆和分析

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1、摘要枳根特异性conti92基因及启动子的克隆与分析细胞生物学专业硕士研究生李凤龙指导教师陈善春研究员姚利晓副研究员捅要柑橘是世界上最重要的果树之一。砧木是果树的基础，砧木的根系是影响接穗对营养、水分和无机盐吸收的关键功能器官，同时，也是直接对抗土壤微生物、干旱、酸性和重金属侵害的第一道防御系统，因此，根对于植物的生长发育及其产量具有重要的生物学意义。目前，在拟南芥等模式植物中，根生长发育及代谢相关基因的研究已取得了较大进展，许多根特异表达的功能基因和调控序列已进行克隆和分析；而在柑橘中，相关研究报道很少。因此，开展柑橘根特异表达基

2、因和调控序列的克隆和分析对促进柑橘等果树品种根部相关性状的基因工程定向改良工作具有重要的研究价值，也是柑橘基因工程育种的热点方向之一。枳(而以cf，-淞啦妇纪)是我国主导砧木品种。本研究在枳根差减cDNA文库中筛选出的11nigellessiIlgleton297和contig22与枳根全长cDNA文库中的C0nti酡完全匹配，利用生物信息学、分子生物学及转基因技术对Conti醇进行了基因和启动子的克隆及表达分析，主要结果如下：1、conti簖组织表达分析conti萨与Ci缸1lsFunctionalGenoIIliCsProjec

3、t(CFGP)中登录的23个EST具有高度序列同源性，这23个EST序列大多来源于柑橘根cDNA文库。以枳1月龄苗、6月龄苗、20年生成年树的根和叶组织为材料，运用Real．TimePCR技术对Conti簖进行相对表达量分析，结果表明conti醇在根中的表达量分别是叶中的的46．34、74．82、110．25倍，进一步说明conti醇具有根特异性表达。2、Conti醇基因特征conti醇核苷酸序列全长801bp，含1个内含子(104bp)和2个外显子。其开放阅读框长471bp，37端非翻译区含加尾信号AATAAA。3、conti醇编

4、码蛋白特征conti醇编码主要乳胶蛋白(major1ateXprotein，MLP)，含b鸭卫I功能域，两南大学硕十学位论文由156个氨基酸组成，分子量为17．63kDa，等电点为5．49。二级结构预测含3个Q-螺旋和5个B．折叠，包含有的一个保守疏水基结合位点和一个富含甘氨酸的回环结构。4、conti醇启动子的克隆与分析通过1次同源克隆和2次YADE．PCR，获得conti醇的5’端上游1685bp调控序列。并运用Pl锄tC』堰E软件对该序列进行启动子结构分析，在序列中发现有TA=rA．box、CAAl’．box等一般启动子结构的

5、核心元件，还具有CC丸盯、嬲．2-box、CA=I'．box、MBS、TGACG-motif等特异性应答元件。5、conti醇启动子表达特异性分析以pBIl21载体为骨架构建了含有conti酡启动子的植物表达载体pBll21．2P，利用农杆菌法转化枳上胚轴，抗性芽长出后进行生根培养，共获得21株转基因苗。GUS染色结果表明在转基因植株根比叶显色深。选取5株转基因苗进行Real．TimePCR，结果表明转基因苗根比叶中的嬲的表达量分别高11．53、7．76、6．02、124．78、5．56倍，说明conti醇启动子具有根组织特异性。关

6、键词：枳，EsT，YADE，根特异性启动子，遗传转化HAbs仃actCloningandanalysisoftheroot—specincgeneconti92anditspromoterf．romj％乃c勿跖sgeneC0ntlgZandltSpromotert，rom尸勿乃C咖跖S洳limnMasterCandidate：LiFenglongSuperVisor：Prof．ChenShanchunAssoiatePro￡YraoLixiaoAbstractCi仃usisoneoft11emostiIllportallt丘uit仃

7、eesilltheworld．Rootstockismeb嬲isof觚t骶es．nerootsystemisakey劬Ctionofo唱a11sinabsorbingnl】埘tioIl，watcr，in0曙弧icsalts锄dsoon．Me删le，itisalsomedircctdefeIlsesystemagaillstpathogeIl，droug虬andheaVymetals．Therefore，r00thaSiIllportalltbiolo西calsi鲥6c觚ceiIlplantgrowlllaIldyield．hlt11

8、emodelplam，彳眦6f和芦如砌口加M，maIlyoft11eroot—sp鲥矗cgellesa11dregulat(，巧sequeIlceshavebeeIlcloned锄d锄alyzed．Butinci仃Ils，theres