玉米胚乳特异性启动子的克隆与表达分析

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1、万方数据四川农业大学硕士毕业论文SichuanAgriculturalUniversityMasterDissertationCloneandexpressionanalysisofMaizeendospermspecificpromoterBy：WangHanyu(Major：BiochemistryandMolecularBiology)DirectedbyProfessorCaomo-juMaizeResearchinstituteSichuanagriculturaluniversityMay2014万方数据四川农业大学硕士毕业论文论文独饲性声明IJlUlI

2、H。112IIIHlH。MH8。III本人郑重声明：所呈交的学位论文是我个人在导师指导下进行研究工作所取得的成果。尽我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，学位论文中不包含其他个人或集体已经发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得四川农业大学或其它教育机构的学位或证书所使用过的材料。与我～同工作的同志对本研究所做的任何贡献均己在论文中作了明确的说明并表示了谢意。研究生签名：一了乞漱导一／乞1『烁彳关于论文使用授权的声明e)‘)，够年√月7工日本人完全了解四川农业大学有关保留、使用学位论文的规定，即：学校有权保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和电子版，允许论

3、文被查阅和借阅，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编学位论文。同意四川农业大学可以用不同方式在不同媒体上发表、传播学位论文的全部或部分内容。研究生签名：、一；导师签名：啦萄d臼，v年乡月，二日d6，够年∥月，二日万方数据四川农业大学硕士毕业论文摘要玉米胚乳中存在着大量与淀粉合成酶、醇溶蛋白合成酶、谷蛋白合成酶相关的基因，并且有部分受胚乳特异性启动子调控，只在胚乳中特异性表达。随着转基因技术的快速发展及转基因研究领域的不断扩大，对组织特异性启动子的研究逐步受到重视。本研究旨在从玉米自交系18．599红中克隆淀粉合成酶基因ZMGBSS、谷蛋白基因ZMGTl、SC

4、3以及醇溶蛋白基因ZElN、BNl5D14A的启动子跚、GT、SC、ZEIN、BN，对其表达的组织特异性及外界诱导因素进行分析，构建了这些启动子的瞬时表达载体，利用基因枪法通过转化胚乳，分析其启动活性。研究结果如下：1、利用高保真酶KODFx从玉米自交系18．599红基因组DNA成功克隆出2000bp左右的胚乳特异性启动子GBSS、GT、SC、ZEIN、BN序列，并对克隆片段进行回收测序。将测序结果与NCBI上B73的基因组信息比对，其相似性分别为97％、99％、99％、97％和99％。2、提取玉米自交系18．599红授粉15天后的胚乳和胚以及出苗10天后的根和叶的

5、RNA，反转录成eDNA，以18srRNA作为内参对ZMGBSS、ZMGTl、SC3、ZEIN、BNl5D14A基因进行半定量PCR分析，结果表明，ZMGBSS和ZEIN在胚乳的表达量明显高于在其他组织。而ZMGTl、SC3、BNl5D14A没有表现出明显的组织特异性。3、通过荧光实时定量PCR对基因ZMGBSS、ZMGTl、SC3、ZEIN、BNl5D14A受外源激素诱导后的表达进行分析，结果表明，ABA诱导可导致基因ZMGBSS和ZEIN的表达量明显提高。蔗糖诱导可导致基因ZMGTl和BNl5D14A的表达量明显提高。4、构建了启动子GBSS、GT、SC、ZEI

6、N和BN的瞬时表达载体，即pGBSS-Luc、pGT-Lue、pSC-Luc、pZE／N-Luc和pBN-Luc，同时构建了瞬时表达载体pUbi-Luc作为对照，构建了瞬时表达载体pUbi．Gus作为内参，内参对照主要用来消除不同转化所导致的差异。将内参载体与目的载体按照质量比为1：4的比例混合，基因枪转化，转化材料为4小时预处理过后的授粉15天后18．599红的胚乳。结果表明，启动子GBSS、ZEIN和BN的启动活性相对高于SC和BN，但均明显低于组成型启动子Ubiquitin。万方数据四川农业大学硕士毕业论文5、在外源因素诱导表达分析中，转化受体材料分别为葡萄糖

7、、蔗糖、ABA和GA诱导4h后的胚乳，利用基因枪转化法，按照内参载体与目的载体以1：4的比例混合进行转化，结果表明，受到ABA诱导的启动子GBSS、ZElN活性有明显提高，受到蔗糖诱导的启动子GT、BN活性也有一定的提高，但启动子阳却表现为受所有供试处理抑制。关键词：玉米；胚乳特异启动子；瞬时表达载体：基因枪转化：II万方数据AbstractTherearealotofgenesrelevanttostarchsynthase，prolaminsynthetase，glutelinsynthaseinmaizeendosperm．Partsofthesegene