大豆种子特异性启动子的克隆与功能研究

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1、南开大学博士学位论文大豆种子特异性启动子的克隆与功能研究姓名：财音青格乐申请学位级别：博士专业：微生物学指导教师：邢来君20040401南开大学博士研究生毕业(学位)论文中文摘要随着分子生物学理论和基因工程技术的不断发展，植物转基因技术已成为一种新型农业技术，全球性生物农业的大发展是大势所趋。但是，目前的植物基因工程技术也有不少不足之处，如表达量低、遗传不稳定和基因沉默等，为了克服这些缺点，进行了多方面的探索和研究，提出了多种改进和完善植物基因工程技术的方法和策略。这些方法和策略中，种子特异性启动子的研究和应用是改进植物基因工程技术的一项重

2、要环节。所谓的种子特异性启动子是指只有在种子成熟的冲、后期启动下游基因，在种子组织中特异性地、大量转录和表达其下游基因的启动子。种子特异性启动子～般来自种子或胚乳中富含的贮藏蛋白基因的启动子。大豆B一伴球蛋白是大豆种子贮藏蛋白的重要组成部分。大豆B一伴球蛋白由Ct一、n，_和B一亚基等三个亚基组成。本研究通过PCR方法从大豆品种～吉林43基因组DNA中分离到大豆D一伴球蛋白Q一亚基基因启动子片段(BCSP501)，并对此片段进行TAILPCR延伸，获得了启动子片段BCSP666。序列分析表明，启动子片段BCSP666中含有种子特异性启动子所

3、需的启动子序列元件：TATA盒、CAAT盒外、A厂r富含序列元件、RY重复序列元件、AGCCCA序列元件、TACACAT序列元件、ACGT序列元件、E盒等多种多拷贝的序列元件。据此推测该启动子片段具有种子特异性启动子活性。以该片段构建种子特异性表达GUS基因的植物载体pBll21．666，以花蕾转化方法转化拟南芥，转基因拟南芥中的GUS酶荧光光度分析和组织化学检测均表明，GUS基因在启动子片段BCSP666调控下获得了种子特异性表达。再以BCSP666为基础，通过TAILPCR方法再次延伸而获得启动子片段BCSP952，并与其它12种种子特

4、异性启动子序列进行了序列对比分析，进一步证实了BCSP952的种子特异性启动子序列结构特点。这是首次对大豆13一伴球蛋白n．亚基基因启动子进行序列结构分析和种子特异性功能鉴定。同时，通过PCR技术从大豆品种～吉林43基因组DNA中分离到大豆0一伴球蛋白d7．亚基基因启动子片段(BCSP408)。序列分析表明，这一启动子片段与已报道的a’一亚基基因启动子相应序列之间的序列同源性达到98％。并用这一启动子和深黄被孢霉△6．脂肪酸脱氢酶基因(MID6D)构建了种子特异性表达Y一亚麻酸的植物表达载纬pBMl408。通过农杆菌介导法将这一植物表达载体

5、pBMl408转化到大豆子叶节，经过诱导和筛选培养，获得了卡那霉素抗性转基因大豆植株。关键词：B一伴球蛋白，大豆种子特异性启动子，序列元件，拟南芥，GUS，Y·亚麻酸壹茎查兰堕主型壅生生些!堂垡!丝苎一一生奎!!蔓ABSTRACTA1thoughplantgeneengineeringhasbeendevelopingrapldly1nrecentyears。therearealotofproblerossuchaslowexpresslonlevel，unstablenessandgenesilence．Toresolvethesepro

6、blems，manystrategieshavebeendevelopedineludingthecloningandapplicationofseed—speeificpromoterswhichiSanimportantmethodusefultoimprovetheplantgeneenglneerlng·Theso—calledseed—specificpromoters，whicharealwaysobtainedfromtheS'-upstreamregulatorysequencesofseed—storageprotelng

7、enes，ODlYexpresstheirdownstreamgenesfrommidtolatestageofseedmaturation·AndthereiSnoormuchlowerexpressioninothertlssuesexceptseeds-0一Conglycinin，whichisakindofstorageproteinsinsoybeanseeds，iSusuallYsynthesizedandaeoumulatedexclusirelyinseedtissHesofthemidtolatestagesofembry

8、ogenesis．ThesoybeanB—conglycininiscomposedofthreemajorsubunits：Ⅱ一subunit．Ⅱ。subunitandB—su