棉花种子特异性启动子的克隆、载体构建及△9elo基因的转化研究

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1、棉花种子特异性启动子的克隆、载体构建及△9Elo基因的转化研究1前言1.1植物启动子的简介植物在其生长和发育的过程中，基因的表达受各种理化的因素调节控制，根据自身的需求和环境的改变做出相应的反应，定时、定量以及定位地表达所需的基因产物。在基因表达的过程中，涉及到各个层次的精细的调控，包括DNA水平、转录层面、转录后过程、翻译水平、翻译后加工、运输过程和定位等。其中，转录水平调控是基因表达调控的关键部分，尤其是转录起始水平的调控对基因表达是极其重要的。启动子是驱动基因转录必不可少的调控元件，发挥着重要的作用（王瑞琲

2、，2008）。因此，研究植物的启动子，有利于更好地分析基因的表达，对进一步研究植物的生长发育有着重要意义。启动子（Promoter）是基因转录表达的开关，是一段位于功能基因5端上游的DNA序列，其含有特定的保守基序，其长度因生物种类而异。在启动子区有多种顺式作用元件，识别RNA聚合酶，指导全酶与模板的正确结合，形成转录起始复合体，决定转录的方向和效率以及所使用的RNA聚合酶的类型，精确而有效的启动功能基因的表达。真核细胞中RNA聚合酶有三类，即RNA聚合酶I、II、III，根据RNA聚合酶的不同种类，真核生物启动

3、子可以分为三种：I型启动子（rRNA基因启动子）、II型启动子（mRNA基因启动子）、III型启动子（tRNA基因启动子），高等植物启动子属于mRNA基因启动子，即II型启动子，由RNA聚合酶II识别，控制众多编码蛋白质基因的表达（王莹等，2007）。高等植物II型启动子区基本上可以分为两部分：一部分是核心启动区，包括转录起始点附近的起始子及邻近的TATA框，它是形成普遍性转录结构所需要的，决定转录起始点和转录频率；另一部分是上游调控区，是位于TATA框上游的保守序列，它决定基因转录的特异性和活性。这两部分都参与

4、基因转录的调控，但后一部分起主要的控制作用（胡廷章等，2007）。启动子在不同的植物中其种类和数量都有差异，但是他们有着相对保守的序列和元件，如转录起始位点、TATA-box、CAAT-box、GC-box等，这些元件对基因的转录表达及基因表达的时空特性是不可或缺的（Dattaetal.,1998）。.1.2植物启动子的分类植物基因启动子按其特点和作用方式的不同大体可以分为三种：组成型启动子、诱导型启动子以及组织特异性启动子。除此之外，还有两类较为特殊的启动子，双向启动子和可变启动子。由于划分界限不是绝对的，一种

5、启动子可能在特征上会与其它启动子发生交叉。组成型启动子（constitutivepromoter）能够调控目的基因在时空上无差异的持续稳定表达的启动子。它的特点是：启动的起始频率和启动效率不会受到时空及外界因素的影响；功能基因的表达量是一定的，并且表达具有连续性；蛋白和RNA的表达量恒定；功能基因在任何组织部位和任何发育时期都会表达（Sandersetal.,1987）。植物基因工程中被广泛使用的组成型启动子主要来自于根瘤农杆菌、病毒和植物中，例如：于花椰菜花叶病毒的MV35S启动子是双子叶植物转基因中应用非常广

6、泛的启动子；水稻肌动蛋白ActinI启动子和玉米泛素Ubiquitin启动子是单子叶植物转基因工程中常用的启动子；来自于细菌的NOS启动子和Ocs启动子，在植物基因工程中也经常应用。CaMV35S启动子来自花椰菜花叶病毒（cassavavirusmosaicvirus），在植物转基因工程中，被广泛的使用在对双子叶植物的研究中。由于该启动子驱动花椰菜花叶病毒基因组所生成的转录产物沉降系数为35S，故将这种驱动花椰菜花叶病毒基因组表达的启动子称为CaMV35S启动子，简称35S启动子。在植物转基因工程中，35S整合到

7、植物基因组中可以在植物不同的生长时期和大部分器官内启动下游基因高效表达（Sandersetal.,1987）。..2材料与方法2.1试验材料2.1.1植物材料启动子克隆材料：海岛棉（Gossypiumbarbadense）新海40，由新疆德佳种业公司提供。受体材料：陆地棉（Gossypiumhirsutum）邯无198，由邯郸市农业科学院、河北农业大学提供；拟南芥（Arabidopsisthaliana）为野生型。.2.1.2载体及试剂克隆载体PMD18-T购于TAKARA公司，中间载体PAUX载体、表达载体pC

8、amBAR载体为山东农业大学生科院实验室馈赠，表达载体pBI121为山东农业大学农学院棉花分子育种实验室保存，含球等鞭金藻（Isochrysisgalbana）Δ9Elo基因的载体pYES2.0（Lietal.,2011）为南开大学的分子微生物学与技术教育部重点实验室馈赠。TaqDNA聚合酶、PfuDNA聚合酶购自Promega公司，限制性内切酶购自Ferme