载基因壳聚糖纳米粒的初步研究

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1、酉Ⅲ大学颀士学位论文载基因壳聚糖纳米粒曲初步研究因递送系统，具有良好的应用前景。目前，制备载基因纳米粒所采用的载体材料主要有天然高分子聚合物如壳聚糖、明胶，合成聚合物如PLA、PLGA等。作为无毒、来源丰富、具有良好生物相容性和生物可降解性的壳聚糖正成为应用广泛的基因传输载体材料，显示出广阔的应用前景和经济前景。壳聚糖是一种从虾皮，蟹壳等提取出来的天然高分子多糖，它由氨基葡萄糖和N一乙酰一氨基葡萄糖以B—i，4甙键结合而成，分子量一般为几万一几十万。壳聚糖的分子链上有许多游离氨基，在酸性条件下，可发生质子化而使壳聚糖分子带正电荷，与带负

2、电荷的DNA分子通过静电结合，并在脱水剂作用下发生复合物问的相互聚集，形成载基因的壳聚糖纳米粒。同时壳聚糖可生物降解，与人体有很好的生物相容性。有关壳聚糖纳米粒基因传递系统的研究报道虽然不多，但已经显示出良好的应用前景。本研究选用壳聚糖为载体材料制各载基因壳聚糖纳米粒，递送pORF—lacZ报告基因，以建立载基因壳聚糖纳米粒基因传输系统的技术平台，为后期的体内及临床研究打下坚实基础。0西蛾大学颢±学位论文载基园壳聚糖纳米粒的扔步j

3、)}究第一部分质粒D眦的提取和纯化基因治疗的非病毒传递系统研究中所递送的基因是目的基因的一个表达系统，通常

4、为重组质粒表达载体。与经典制剂学选择模型药物一样，基因递送系统的研究首先应选择并大量提取、纯化模型基因。当前用于递送系统研究的基因可分为两类，一类是无治疗意义的报告基因，另一类是有临床应用价值的治疗基因。报告基因由于其检测手段简单、易行且细胞内背景活性低，可将胞内信号放大，具有较高灵敏度而被广泛应用于评价所设计的递送系统传递外源基因的技术可行性。本课题选择含有B一半乳糖苷酶基因的pORF．1acZ为模型基因，采用EndoFreePlasmidGigaKit方案大量提取和纯化了pORF．1acZ质粒基因以满足本课题实验需要。1．1仪器和试

5、药1．1．1菌株和质粒pORF—lacZ(3．054kb，Invivogen，usa)大肠杆菌(DH5a—Ecoli)1．1．2工具酶和DNA分子量标准限制性内切酶EcoRI(Sigma)线性DNA分子量标准：A,-EcoTl4Imarker(华美生物)1．1．3其他主要仪器和试药GBCCintra10e紫外分光光度计(澳大利亚GBC公司)BeckmanAllegen22R高速冷冻离心机(美国Beckman)QZX—c空气浴恒温摇床(哈尔滨市东明医疗器械厂)DYY-6B电泳仪(北京六一仪器厂)HoeferTMHE33电泳槽(Amersh

6、amBiosciences)H．1漩涡混合器(上海青浦沪西仪器厂)Endo—free质粒纯化试剂盒(Qiagen，CA．USA)琼脂糖(AGAROSE，华美生物工程公司)髓m大学碗士学位论文载基强壳聚糖纳米粒昀初步研究电泳上样缓冲液(6x，华美生物工程公司)各种质粒提取用试药[P1(重悬缓冲液)、P2(裂解缓冲液)、P3(中和缓冲液)，FWB2(QIAfilter洗脱缓冲液)，QBT(平衡缓冲液)，QC(冲洗缓冲液)，QN(洗脱缓冲液)，ER(去内毒素缓冲液)]LB培养基试验用水均为双蒸水1．2方法和结果1．2．1细菌小量培养1)用无菌

7、的Tip尖挑取经CaCI。转化的单菌落，接种于装有2mlLB培养液(含卡那霉素，30ug／mt)的培养管中，封好管口。2)将培养管置于37。C恒温空气摇床上300rpm过夜培养至生长饱和。1．2．2质粒基因的小量提取1)取1．5ml培养液至Ep管中，120009离心30sec，弃上清。将EP管的管1：3朝下放置在滤纸上，让培养液滴干。2)将细菌沉淀悬浮于lOOul的P1中，强烈振荡(用漩涡仪)混匀，盖子打开，室温放置5min。3)加入200ulP2，盖严管盖颠倒Ep管以混合内容物。不要强烈振荡，置冰浴上约5min。4)加入150ulP3

8、，将管盖朝下温和振荡lOsec，冰浴上放置lOmin。5)常温下120009离心5min，将上清液移至1个新Ep管中。6)加入2倍容积乙醇(室温)，振荡混匀，室温下放置5～lOmin7)常温下120009离心5min。8)弃去上清，加入lml70％／,醇振荡漂洗沉淀，120009离心2min．重复此步骤一次9)弃去上清液，将管倒置放在滤纸上，室温下蒸发痕量乙醇10～15min。10)加入50ulTE(PH8．O)溶解DNA，加入0．5ulRNase液(1mg／m1)至其终浓度氆珀夫学硕ji学证论文载摹函壳聚糖纳米粒匏枥步研究为lOug／

9、ml，37。C反应lOmin酶解RNA分子。11)直接加入5ulP3和100ul乙醇，--20*(2放置10～15min沉淀DNA，120009离心5min。12)用70％乙醇洗涤沉淀1～2次，干燥，然后用