灯盏花素对体外高压致视网膜神经节细胞凋亡的影响

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1、灯盏花素对体外高压致视网膜神经节细胞凋亡的影响作者：盛艳梅　孟宪丽　张艺　龙怡【摘要】　　目的考察灯盏花素对体外高压诱导的视网膜神经节细胞(retinalganglioncells,RGCs)凋亡的影响，探讨灯盏细辛视神经保护作用的物质基础。方法用胰酶消化法将20只出生2～3d的SD（Sprague-Daplatedin6-ininineachmuneohistochemistrymethodandapoptoticcellsethod.Andsomeofthe5-dayculturecellsyocytesofCasp

2、ase-3proteinandtheapoptosisindexintheexperimentodelgroup(P＜0.05,Ｐ＜0.01).ConclusionsBreviscapinecanprotectretinalganglioncellsagainstapoptosisbyhighintraocularpressure，azz.］主要含有以灯盏花素为主的黄酮类、香豆素类等化合物［1］。研究证实其有减少血管外周阻力，改善大脑微循环及抗血小板聚集的作用［2］。随着对其药理作用的深入研究，其应用范围正在拓展。实验发

3、现它在青光眼治疗方面可以通过多种途径起到视神经保护作用［3～4］。作者对胡竹林［5］、段永恒［6］使用的培养瓶注气式加压装置加以改进,建立了更加科学合理的体外高眼压模型。并在考察了灯盏细辛多组分对常压下RGCs存活的基础上，用该模型进一步考察了其中灯盏花素对体外高压诱导的RGCs的影响，以明确其起视神经保护作用的物质基础，为开发研制理想的青光眼视神经保护剂提供参考。1材料1.1实验动物SD乳鼠（出生2～3d内），♀♂兼用。由成都中医药大学实验动物中心提供，合格证号：川实动管第11号。1.2药品及试剂灯盏花素原料药，购于云

4、南玉溪万方天然药物有限公司，批号：040501；尼莫地平注射液0.2mg·ml-1,德国拜耳公司，批准文号：国药准字J20020102；多聚鸟氨酸（Sigma公司，P-2533），层粘连蛋白（Roche公司，批号：1243217），胰蛋白酶（Gibco公司，批号：1118374），胎牛血清(Gibco公司，批号：1216472)，小牛血清(成都哈里生物有限公司，批号：20040125)，DMEM高糖培养基(Sigma公司，批号：1242226)，5-溴-2′-脱氧脲苷(Brdu，武汉博士德有限公司，批号：90139520

5、)。1.3主要仪器DMIL莱卡倒置相差显微镜，CO2孵箱（SANYOMCO-15AC），奥林巴斯体式显微镜等。1.4统计学方法实验数据采用单因素方差分析，应用SPSS12.0统计软件进行处理。2方法2.1培养板的处理取6孔板，于每孔预先置入一血盖片(24mm×24mm)，加入0.2mg·ml-1多聚鸟氨酸1ml，振荡均匀，室温静置2h后，吸弃上清液，用适量PBS液洗涤三次，加入5μg·ml-1层粘连蛋白2ml，置37℃，5％的CO2孵箱中过夜，备用。2.2细胞悬液制备及接种培养将乳鼠无菌条件下断颈处死摘取眼球，在体式显微

6、镜下沿角膜剪开,钝性分离出视网膜组织。用0.125%的胰蛋白酶37℃下消化，30min后加入纯小牛血清终止消化，用无菌钢筛网滤过。将滤液1000r·min-1离心5min，弃上清液。加入完全培养液，吸管吹打使之制成单细胞悬液。计数并调整细胞密度为1ml含5×106个细胞。将细胞悬液按每孔1ml接种于经包被的6孔板中，培养24h后加入5-溴-2′-脱氧脲苷以抑制非神经细胞生长。2.3高眼压模型制作及药物的加入培养72h后，将覆有细胞的血盖片嵌入到自制玻璃槽内，随机分成每槽6张，各槽内含不同受试药（灯盏花素、尼莫地平用无血清

7、培养液配制）的完全培养液25ml，模型对照组加入等体积的培养液。然后按自行设计的加压装置进行培养，使压力达到10.64kPa。另设正常对照组（压力为0），保持24h后作Caspase-3蛋白免疫组化检测，48h后进行凋亡检测。2.4形态学观察应用倒置相差显微镜每天观察细胞形态及生长情况。2.5RGCs鉴定［7］终止培养后，取两张覆有细胞的血盖片做抗神经元特异性烯醇化酶(NSE)免疫组化染色检查。2.6Caspase-3蛋白免疫组化染色检测采用链霉素-生物素复合物（ABC）技术进行检测。血盖片用90%乙醇固定10min，P

8、BS洗三次，每次2min。迈新S-P试剂盒（羊抗兔鼠）A清除非特异性物质阻断过氧化物酶活性，37℃孵育10min。迈新S-P试剂盒B血清封闭，37℃孵育10min，沥去血清，滴加标记一抗Caspase-337℃孵育60min。沥去PBS，加生物素标记二抗（IgG）迈新试剂C，37℃孵育10min。沥去PBS，加链霉菌