灯盏花素对体外高压致视网膜神经节细胞凋亡的影响论文

《灯盏花素对体外高压致视网膜神经节细胞凋亡的影响论文》由会员上传分享，免费在线阅读，更多相关内容在学术论文-天天文库。

1、灯盏花素对体外高压致视网膜神经节细胞凋亡的影响论文盛艳梅孟宪丽张艺龙怡【摘要】目的考察灯盏花素对体外高压诱导的视网膜神经节细胞(retinalganglioncells,.freelplatedin6-ininineachmuneohistochemistrymethodandapoptoticcellsethod.Andsomeofthe5-dayculturecellsyocytesofCaspase-3proteinandtheapoptosisindexintheexperimentodelgroup(P＜0.05,Ｐ＜0.01).ConclusionsBreviscapinec

2、anprotectretinalganglioncellsagainstapoptosisbyhighintraocularpressure，azz.］主要含有以灯盏花素为主的黄酮类、香豆素类等化合物［1］。研究证实其有减少血管外周阻力，改善大脑微循环及抗血小板聚集的作用［2］。随着对其药理作用的深入研究，其应用范围正在拓展。实验发现它在青光眼治疗方面可以通过多种途径起到视神经保护作用［3～4］。作者对胡竹林［5］、段永恒［6］使用的培养瓶注气式加压装置加以改进,建立了更加科学合理的体外高眼压模型。并在考察了灯盏细辛多组分对常压下RGCs存活的基础上，用该模型进一步考察了其中灯盏花素对体

3、外高压诱导的RGCs的影响，以明确其起视神经保护作用的物质基础，为开发研制理想的青光眼视神经保护剂提供参考。1材料1.1实验动物SD乳鼠（出生2～3d内），♀♂兼用。由成都中医药大学实验动物中心提供，合格证号：川实动管第11号。1.2药品及试剂灯盏花素原料药，购于云南玉溪万方天然药物有限公司，批号：040501；尼莫地平注射液0.2mg·ml-1,德国拜耳公司，批准文号：国药准字J20020102；多聚鸟氨酸（Sigma公司，P-2533），层粘连蛋白（Roche公司，批号：1243217），胰蛋白酶（Gibco公司，批号：1118374），胎牛血清(Gibco公司，批号：1216472

4、)，小牛血清(成都哈里生物有限公司，批号：20040125)，DMEM高糖培养基(Sigma公司，批号：1242226)，5-溴-2′-脱氧脲苷(Brdu，武汉博士德有限公司，批号：90139520)。1.3主要仪器DMIL莱卡倒置相差显微镜，CO2孵箱（SANYOMCO-15AC），奥林巴斯体式显微镜等。1.4统计学方法实验数据采用单因素方差分析，应用SPSS12.0统计软件进行处理。2方法2.1培养板的处理取6孔板，于每孔预先置入一血盖片(24mm×24mm)，加入0.2mg·ml-1多聚鸟氨酸1ml，振荡均匀，室温静置2h后，吸弃上清液，用适量PBS液洗涤三次，加入5μg·ml-1

5、层粘连蛋白2ml，置37℃，5％的CO2孵箱中过夜，备用。2.2细胞悬液制备及接种培养将乳鼠无菌条件下断颈处死摘取眼球，在体式显微镜下沿角膜剪开,钝性分离出视网膜组织。用0.125%的胰蛋白酶37℃下消化，30min后加入纯小牛血清终止消化，用无菌钢筛网滤过。将滤液1000r·min-1离心5min，弃上清液。加入完全培养液，吸管吹打使之制成单细胞悬液。计数并调整细胞密度为1ml含5×106个细胞。将细胞悬液按每孔1ml接种于经包被的6孔板中，培养24h后加入5-溴-2′-脱氧脲苷以抑制非神经细胞生长。2.3高眼压模型制作及药物的加入培养72h后，将覆有细胞的血盖片嵌入到自制玻璃槽内，随

6、机分成每槽6张，各槽内含不同受试药（灯盏花素、尼莫地平用无血清培养液配制）的完全培养液25ml，模型对照组加入等体积的培养液。然后按自行设计的加压装置进行培养，使压力达到10.64kPa。另设正常对照组（压力为0），保持24h后作Caspase-3蛋白免疫组化检测，48h后进行凋亡检测。2.4形态学观察应用倒置相差显微镜每天观察细胞形态及生长情况。2.5RGCs鉴定［7］终止培养后，取两张覆有细胞的血盖片做抗神经元特异性烯醇化酶(NSE)免疫组化染色检查。2.6Caspase-3蛋白免疫组化染色检测采用链霉素-生物素复合物（ABC）技术进行检测。血盖片用90%乙醇固定10min，PBS洗

7、三次，每次2min。迈新S-P试剂盒（羊抗兔鼠）A清除非特异性物质阻断过氧化物酶活性，37℃孵育10min。迈新S-P试剂盒B血清封闭，37℃孵育10min，沥去血清，滴加标记一抗Caspase-337℃孵育60min。沥去PBS，加生物素标记二抗（IgG）迈新试剂C，37℃孵育10min。沥去PBS，加链霉菌抗生物素—过氧化物酶溶液，迈新试剂D，37℃孵育10min。沥去PBS，新配制的显色剂DAB，显色3～5min。以上每步之间