结肠癌患者外周血内皮祖细胞数量及其功能的变化

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1、结肠癌患者外周血内皮祖细胞数量及其功能的变化作者：姜振宇宋晓燕马宁姚程【摘要】目的观察结肠癌患者外周血内皮祖细胞(EPC)数量及其功能的变化。方法选择结肠癌患者32例和对照组34例，密度梯度法分离人外周血中单个核细胞，分化培养14d后，采用RTPCR法检测内皮细胞特异性成分内皮源型一氧化氮合酶(ecNOS)，胎肝激酶1(Flk1/KDR)的表达，采用Dil标记的乙酰化低密度脂蛋白(acLDLDil)和FITCUEA1对细胞染色分别鉴定贴壁细胞为EPC。采用集落形成试验、改良的Boyd

2、en小室及黏附能力测定EPCs的迁移和黏附能力。结果结肠癌患者外周血EPC数量明显增多，黏附能力，迁移能力异常增高。结论结肠癌患者EPC数量及活力均异常增高。【关键词】结肠癌；内皮祖细胞(EPCs)；血管生成【Abstract】ObjectiveToinvestigatechangesinthenumberandactivityofendothelialprogenitorcells(EPCs)fromperipheralbloodinthepatientsononuclearcellscolo

3、ncancerpatients(n=32)andcontrolsubjects(n=34).ImmunocytochemicalanalysisberandmigrationeasuredbycolonyformingunitEPCs(CFUEPCs)assay，modifiedBoydenchamberassay，respectively.EPCadhesionassayedbyreplatingthoseonfibronectincoateddishestocountadherentc

4、ells.ResultsThenumberofEPCsincoloncancergroupbersandactivityareabnormallyincreasedinpatientsin，用PBS浸洗，将FITCUEA1加于上述标本，37℃下孵育1h。激光共聚焦显微镜鉴定acLDLDil和FITCUEA1双染色阳性细胞为正在分化的EPCs。　　1.5EPCs计数　　采用集落形成试验方法。分离EPCs，用人纤维连接蛋白包被6孔板，每孔置入5×106单个核细胞，孵育2h，收集未贴壁细胞(

5、包括EPCs)，调整密度为每孔1×106细胞，置入包被有人纤维连接蛋白的24孔板中，继续培养5d，计数每个样本中每孔的克隆数。　　1.6黏附能力检测　　用胰蛋白酶消化、收集贴壁细胞，将同等数目的EPCs接种在包被有人纤维连接蛋白的24孔培养板，培养30min，用PBS洗去未贴壁的细胞，计数贴壁细胞。　　1.7迁移能力检测　　　　用胰蛋白酶消化、收集贴壁细胞，将M199培养液加入改良的Boyden小室的下室，将2×104EPCs悬浮在M199培养液后注入上室，37℃培养24h，刮去滤膜上面未移动的

6、细胞，用甲醇固定，Giemsa染色，显微镜下随机选择3个视野，计数迁移到底层的细胞数。　　1.8统计学处理　　计量资料用x±s表示，采用SPSS13.0进行组间资料的方差分析。　　2结果　　2.1内皮细胞特异性成分基因水平鉴定　　ecNOS在548bp处出现条带，Flk1在819bp处出现条带，GADPH为内参(图1)。　　2.2细胞染色与鉴定　　UEAI染色呈红色荧光，DiLDL染色呈绿色荧光，UEAI和DiLDL双染色阳性细胞为正在分化的EPCs(图2)。　　2.3各组EPCs数量及黏

7、附、迁移能力的比较　　结肠癌组EPCs数量、黏附和迁移能力均显著高于正常对照组(P＜0.05)。见表1。表1各组外周血EPCs数量和功能测定结果(略)　　3讨论血管EPCs是血管内皮的前体细胞，亦称为成血管细胞(angioblast)，是一类具有游走、增殖并能分化为血管内胞，但缺乏成熟血管内皮细胞表型，也未形成血管的前体细胞〔3〕。1997年，Asahara等人首次分离并证实成年人外周血中存在着能分化为血管内皮细胞EPCs，并在体内证实了其生成血管的能力〔4〕。它不仅在胚胎期参与血管生成，而且在

8、出生后也参与血管新生过程〔5〕。提示EPCs在肿瘤、缺血性疾病、创伤愈合等中的重要治疗作用和广阔的临床运用前景。本文结果表明，结肠癌患者EPCs的数量及活力均异常增高。肿瘤拥有丰富的血管供应，EPCs参与肿瘤的血管发生，促进肿瘤生长已经得到了证实。Muta等人〔6〕的研究表明，EPCs可以特异性蓄积在肿瘤部位。一些细胞生长因子作为介导EPCs从骨髓释放到循环血的信号，例如血管内皮生长因子(VEGF)和粒巨噬集落刺激因子(GMCSF)。VEGF除了直接促进EPCs的动员，还能促进其他生长因子如