塞来昔布联合5-fu对sgc-7901人胃癌细胞凋亡及cox-2、bcl-2、bax的影响

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1、山西医科大学硕士学位论文材料与方法1.材料1.1细胞SGC-7901人胃癌细胞武汉博士德生物工程有限公司1.2主要试剂兔抗人COX-2蛋白单克隆抗体武汉博士德生物工程有限公司兔抗人Bcl-2蛋白单克隆抗体武汉博士德生物工程有限公司兔抗人Bax蛋白单克隆抗体武汉博士德生物工程有限公司免疫组化试剂盒北京博奥森生物技有限公司塞来昔布购自辉瑞公司5-Fu购自上海旭东制药厂胎牛血清杭州四季青生物工程有限公司RPMI1640培养基为GibcoBRL公司产品胰酶武汉博士德生物工程有限公司二甲基亚砜（DMSO）美国Sigma四甲基偶氮唑蓝（MTT）美国Sigma碘化丙啶（P

2、I）北京博奥森生物技有限公司DAB北京博奥森生物技有限公司1.3主要仪器及设备层流洁净细胞培养室山西医科大学寄生虫实验室CO2培养箱（1815TC）SHEL-LAB无菌工作台北京新技术应用研究所流式细胞仪BECTONDICKINSON公司低温冰箱SANYO公司倒置显微镜日本NIKON公司台式离心机湖南湘仪离心机厂光学显微镜上海彼爱姆光学仪器制造有限公司1.4主要试剂的配制（1）MTT溶液（5mg/ml）：取MTT50mg，充分溶解于10mlPBS（0.01M,pH7.2~7.4）中过滤除菌，分装，-20℃保存。（2）磷酸盐缓冲液（1×PBS）缓冲液：称取Na

3、Cl8.5g，KCl0.2g，Na2HPO4?12H2O2.85g，KH2PO40.27g，溶于400mL三蒸水中，调pH值，定容至1000mL，高温高压除菌，4℃保存。（3）0.25%胰酶溶液：称0.25g胰蛋白酶粉，加100mLPBS液，完全溶解后调PH为7.4，2山西医科大学硕士学位论文过滤除菌，密封后4℃保存。1.主要药物的配制（1）塞来昔布原液的配制：以DMSO配成1mol/L的贮存液[13]，放置-20℃冰箱保存，临用时培养液稀释成所需浓度。（2）5-Fu原液的配制:取5-Fu注射液(250mg/支，10ml/支)lmL，加入9mLRPMI-16

4、40培养液，混匀，配制成浓度为2.5mg/mL的5-Fu原液，放置-20℃冰箱保存，临用时培养液稀释成所需浓度。1.1方法2.1.1细胞培养将SGC-7901细胞癌细胞常规培养于含10%胎牛血清和双抗(青霉素100U/ml及链霉素100μg/ml)的RPMI1640培养液中，置于37℃、5%CO2培养箱内培养，隔天换液，2～3d以0.25%的胰酶消化传代。根据相关文献选用药物作用48小时进行实验[13]。1.2.2MTT检测塞来昔布和5-Fu对SGC-7901细胞增殖的影响1.2.2.1单独作用（1）收集对数生长期的SGC-7901细胞，胰酶消化调整细胞密度

5、至7×104/ml，以100μl/孔接种于96孔板，每孔接种7×103个/孔，常氧下、37℃、5%CO2培养24h待细胞贴壁。（2）24h后换液，分别加入赛来昔布（终浓度为0、10、20、40、80、100μmol/L）及5-Fu(终浓度为0、10、20、40、60、80、100μg/mL)，同时设调零组，每组设6个复孔。（3）作用48h后，MTT法检测细胞增殖抑制率。每孔加MTT溶液20μl（5mg/ml），37℃孵育4小时。（4）弃去培养液，每孔加DMSO150μl，振荡至紫色结晶完全消失，用全自动酶标仪测定490nm波长各孔的吸光度A值（A490）。（

6、5）按下式计算细胞增殖抑制率。细胞生长抑制率(R)=(1-A实验组/A对照组)×100%。1.2.2.2联合作用取对数生长期的SGC-7901细胞，调整细胞密度至7×104/ml接种于96孔板，每孔7×103个/孔。24h后换液，将细胞分为8组：对照组、C组（celecoxib20μmol/L）、F1组（5-Fu40μg/ml）、F2组(5-Fu60μg/ml)、F3组（5-Fu80μg/ml）、C+F1组、C+F2组和C+F3组，每组设6个复孔，作用48h后按1.2.2.1检测细胞增殖抑制率1.2.3流式细胞仪检测细胞周期分布（1）取对数生长期的SGC-7

7、901细胞，调整细胞3×105个/孔，接种于6孔板常氧下、37℃、5%CO2培养24h待细胞贴壁。（2）24h后换液，将细胞分为4组：对照组、C组（celecoxib20μmol/L）、F组(5-Fu60μg/ml)和C（celecoxib20μmol/L）+F(5-Fu60μg/ml)组，分别加入相应的药物。（3）作用48h后，用0.25%胰酶消化，离心收集细胞，PBS洗涤2次，70%乙醇固定，4℃过夜，PBS洗涤2次，RNA酶重悬细胞，温育20min，PI染色30min流式细胞仪分析细胞3山西医科大学硕士学位论文周期，得出每个细胞样本中的G0/G1，S，

8、G2/M期细胞的比例。1.免疫组化技术将18mm×2