产铁载体海洋普鲁兰类酵母(aureobasidium+pullulans)hn6.2菌株遗传改良是研究

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1、中国海洋大学硕士学位论文产铁载体海洋普鲁兰类酵母HN6．2菌株遗传改良的研究摘要铁载体是一类铁特异性螯合剂，它是一种小分子量的、对铁离子有高度亲和力的化合物。它在向微生物细胞提供铁元素的过程中起着重要的作用。铁载体通常由细菌、真菌和禾本植物合成，用来从它们的生存环境中寻找并结合铁离子，铁载体可参与生物体细胞外的铁离子转运，络合铁离子后的铁载体还可作为细胞内铁离子的储备物。目前已知，铁载体的生物合成会受到铁离子浓度的影响，当生物体外界环境中的铁离子超过一定浓度范围时，铁载体的合成受到极大的抑制作用。人们已经从各种微生

2、物体内分离鉴定了众多铁载体，按照化学结构将它们分为三大类，艮IJJD茶酚型、氧肟酸盐型和羧酸盐型铁载体。铁载体在医学、农业、、核燃料回收、治理金属污染和石油污染中有着巨大的应用潜力。在本实验室之前的研究中，普鲁兰类酵母(Aureobasidiumpullulans)HN6．2是一株从青岛近海海泥中分离得到海洋酵母。它的铁载体产量较高，但在铁载体合成的同时产生大量的胞外多糖，主要是由普鲁兰多糖，对铁载体的生产和提取产生不利的影响。在本研究中，利用化学诱变和基因敲除的方法对普鲁兰类酵母HN6．2进行遗传改良。利用化学诱

3、变剂甲基磺酸乙酯(EMS)对普鲁兰类酵母HN6．2菌株进行诱变，并筛选出一株胞外多糖产量少，铁载体产量提高的突变株HNl8。然后利用单因子变量试验的方法，对突变株HNl8产铁载体培养基成分和摇瓶培养条件及5升发酵罐条件进行优化，最终确定最优培养基组份为：蔗糖2．5％(w／v)，硝酸铵O．5％(w／v)，磷酸氢二钾0．3％(w／v)，一水合柠檬酸0．1％(w／v)，硫酸镁0．008％(w／v)，硫酸锌0．0002％(w／v)，10mM的L一鸟氨酸，培养基初始pH值为5．5。最佳摇瓶培养条件为：转速180rpm，培养温

4、度28摄氏度，培养时间为120h，在此条件下铁载体产量可达0．24g／L。在5升发酵罐中的最佳发酵条件为：通气量5L／min，搅拌速度200rpm，温度28℃，发酵时间时间156h，在此条件下，铁载体产量最高可达O．51g／L。通过构建敲除载体，成功敲除了产铁载体普鲁兰类酵母HN6．2菌株中普鲁i中国海洋大学硕=匕学位论文兰多糖合成酶基因尸觇J『，筛选得到了敲除菌株DPSl，与原始菌株相比，该敲除菌株胞外多糖产量明显减少，铁载体产量上升。由于敲除菌株普鲁兰多糖产量的下降，在化学法提取铁载体过程中省略添加乙醇去除普鲁

5、兰多糖的步骤，简化了铁载体的提取流程，达到了预期目的。关键词：普鲁兰类酵母铁载体胞外多糖‘诱变基因敲除PULl基因中国海洋大学硕士学位论文Geneticimprovementofsiderophore—producingmarineyeastAureobasidiumpullulansHN6．2AbstractSiderophoreisakindofiron—specificchelators，whicharelow-molecularweightcompoundspossessingahighaffinityfo

6、rferricion．Itplayedanimportantroleinsupplyingirontothecellofmicorobes．Theyareproducedbybacteria，fungiandgraminaceousplantsforscavengingironfromtheirlivingenvironment．Theyarenotonlysecretedtotransportextracellularironbutalsoproducedintracellularlyprimarilyforir

7、onstorage．Ithasbeenknownthatthebiosynthesisofthesiderophoreisinfluencedbyironconcentration，whichCangreatlyinhibitthesynthesisofsiderophorewhenitbeyondsacertainrange．Siderophoreshavebeenbiochemicallycharacterisedfromvariousmicroorganismandtheycanbedividedintoth

8、reegroupsbasedontheirchemicalstructures：catechols，carboxylatesandhydroxamates．Thereareanumberofpotentialapplicationsforsiderophoresinmedicine，agriculture，reprocessingofnuclearfuel，