普鲁兰酶性质的研究

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1、一如何获得目的菌株(1)普鲁兰酶产生菌的初筛。収log土样加入到装有90汕无菌水和玻璃珠的三角瓶屮，振荡30min,使样品充分打散后，吸取1.OmL于富集培养基中，在35°C下振荡培养48h。取培养液稀释涂布于以普鲁兰糖为唯一碳源的平板分离培养基上，35°C温箱中培养48h。将平板倒置，注入10mL无水乙醇，室温放置24h,观察菌落并挑出周围出现透明圈的菌落，于斜而培养基上进行培养。(2)菌种纯化。用接种坏从斜面培养基上挑取少量菌株接入平板固体培养基，采用平板划线分离法对菌株进行纯化，将产生透明圈的单菌落接入斜面培养基，供菌种复筛用。(3)摇瓶培养法复筛。将斜面保存的菌种接入种子培养基中，35

2、°C振荡培养24h后，制得菌悬液，将菌悬液以4%接种量接入菌种筛选摇瓶培养基，35°C振荡培养48h后，测定发酵液中普鲁兰酶活力。二目的产物的检测方法三目的菌产酶条件的优化纯酶的获得以及酶学性质研究方案酶的初步纯化ItO兰Promozyme100mL（NovoNordisk公词）I透析脱盐后•离心（8000r/min.15min）II；上清液沉淀（弃去）♦以1mol/LHCL调pH至4.5-5.04力D（NH4）29C）4达25%饱和度42〜4V24h后.离心（8000r/min,15r/min）4II上清液沉淀（弃去）4加（NKbSCX达25%饱和度I2-4t!!>»24h后.离心（8000

3、r/min.15min）44I上清液（弃去〉沉淀4以PH5.0.0.02mol/L®«缓冲液溶解♦对pH5・0・0・02mol/LW酸缓冲液透析48h4透析蔽（粗酶液）冷冻干«J9fflB«*2.45g酶的部分纯化取1g上述粗酶蛋白洛于卩115・0.0.()2mol/L的醋酸缓冲液•上预先平衡好的I)F：E-纤维素(DEAF?52)柱.用PII5.0.()•()2m(>l/L醋酸缓冲液洗脱•分部收集.每管1()ink.测定每管收集液的酶活。将具最大活性峰的收集液合并•冷冻浓缩后•上预先平衡好的SrphM林OKX)凝胶柱(2.0x7()nn).用PII5.0.0.()2屮1/1•的醋酸缓冲液洗

4、脱•分部收集•每管5mL.测定徒管收集液的酶活•将呈现酶活的洗脱峰合并•冷冻干燥后•得1.2mg酶蛋白。普鲁兰酶的部分酶学性质。(1)最适温度及热稳定性。将普鲁兰酶液分别于不同温度下测其活力，以活力最高者为100%对照，测试其最适反应温度。在不同温度下，将普鲁兰酶液分别保温lh后，测定残余酶活力，以活力最高者为100%对照，试验温度对普鲁兰酶稳定性的影响。(2)最适pH值及pH值稳定性。将普鲁兰酶液分别于不同pH值下测其活力，以活力最高者为100%对照，测试其最适反应pH值。将普鲁兰酶液在不同pH值缓冲液中于室温保持24h后，测定残余酶活力，以活力最高者为100%对照，试验pH值对普鲁兰酶稳定

5、性的影响。(3)金属离子对普鲁兰酶活性的影响。将不同的无机盐溶液与等量普鲁兰酶液混合，并使混合液屮的无机盐最终浓度达到0.5mmoL/L,按1.2.3的方法测定酶活力，设不加金属离子组为对照组，测定金属离子对普鲁兰酶活力的影响。定化》五对该酶的改性方案(基因工程手段，酶分子修饰,基因工程手段BaciUusnaganoensix(ATCC53909)构建胖鲁兰酹基因的表达我体酣毎的转化■岛左达转化子的捕选工程角实验室发毎条件的优化的的学及苗应用性质的研究六酶的产业化《酶反应器，产业化生产中需要注意的问题〉