基于自噬水平研究x射线对成骨细胞的作用

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1、分类号：R78密级：公开研究生学位论文论文题目（中文）基于自噬水平研究X射线对成骨细胞的作用Effectonautophagytoosteoblastirradiated论文题目（外文）byX-ray研究生姓名胡旭瑞学科、专业口腔医学·口腔临床医学研究方向细胞生物学学位级别硕士导师姓名、职称刘斌教授李屹老师论文工作起止年月2016年08月至2018年03月论文提交日期2018年04月论文答辩日期2018年05月学位授予日期2018年06月校址：甘肃省兰州市I基于自噬水平研究X射线对成骨细胞的作用中文摘要目的：探讨X射线对MC3T3-E1小鼠成骨细胞增殖、凋亡和矿化能力的影响

2、，并从自噬角度初步阐述其可能的分子机制。方法：体外培养MC3T3-E1细胞，以6MV/min剂量脉冲速率的医用直线加速器照射，分组如下：空白对照组、0.25Gy组、0.5Gy组、1Gy组、2Gy组和4Gy组。采用MTT法筛选多西环素(doxycycline,DOX)作用浓度，通过单丹磺酰尸胺(monodansylcadaverine,MDC)染色法确定DOX抑制自噬现象的作用时间，筛选多西环素浓度为2.5nM时干预48h对上述分组进行自噬抑制。采用MDC染色法观察X线照射72h后的自噬现象；平板克隆实验检测细胞的增殖活力；成骨诱导21天后茜素红染色观察矿化结节数量；ALP试

3、剂盒检测矿化能力；Hoechst33342染色和流式细胞术检测成骨细胞凋亡情况；免疫印迹法检测蛋白LC3、Atg5、Beclin-1、p62、Bcl-2、Bax、Caspase-3、Runx2的表达。结果：平板克隆实验显示各辐照组细胞增殖活力明显降低（P<0.05），且有剂量依赖性；茜素红染色和ALP检测显示，辐照组的矿化结节数量减少（P<0.05），矿化程度降低，ALP活性降低，且有剂量依赖性；单丹磺酰尸胺（MDC）染色显示，各实验组随着辐照剂量的增加，荧光强度均有增加；Hoechst33342细胞凋亡形态学观察发现辐射组在72h后细胞核凝聚数量显著增多，凋亡小体数目明显

4、增多；流式细胞术结果显示辐照组随着剂量和时间的增加，细胞凋亡率上升（P<0.05）；Westernblot检测显示Beclin-1、Atg5、Lc3II/Lc3I和除0.25Gy外的Caspase3蛋白相对表达量随着辐射剂量的增加均明显上调，差异具有统计学意义（P＜0.01）；p62和Bcl-2/Bax蛋白表达量明显下调，差异具有统计学意义（P＜0.01）；Runx2的表达除0.25Gy外明显下调，差异具有统计学意义（P＜0.01）。MDC染色结果显示加入2.5nMDOX干预48h后，各辐照组荧光强度基本消失；平板克隆实验显示加DOX组细胞增殖活力增高（P<0.05）；茜素

5、红染色和ALP检测显示加DOX组细胞矿化结节数量增多（P<0.05），ALP活力升高；Hoechst33342细胞凋亡形态学观察发现加DOX组48h，凋亡小体数目增多；流式细胞术结果显示加DOX组凋亡率增高（P<0.05）；Westernblot检测Beclin-1、IIAtg5、Lc3II/Lc3I和除0.25Gy外的Bcl-2/Bax蛋白相对表达量明显下调，差异具有统计学意义（P＜0.05）；p62在辐射剂量1Gy-4Gy时蛋白表达量下调，差异具有统计学意义（P＜0.05）；Runx2的表达量均明显上调，差异具有统计学意义（P＜0.05）；Caspase3在辐射剂量2G

6、y和4Gy时蛋白表达量上调，差异具有统计学意义（P＜0.05）。结论：X射线可体外诱导MC3T3-E1成骨细胞发生凋亡；抑制自噬后，凋亡加重，其机制可能通过激活线粒体释放凋亡酶激活因子Caspase-3蛋白有关。X射线可体外抑制MC3T3-E1成骨细胞的矿化能力；抑制自噬后，可减轻X射线对成骨细胞矿化能力的损伤，其机制可能与上调ALP活力和成骨相关基因Runx2有关。关键词：MC3T3-E1，自噬，X射线，矿化，凋亡IIIEffectonautophagytoosteoblastirradiatedbyX-rayAbstractPurpose:Toexaminetheeff

7、ectsofX-irradiationontheproliferation,apoptosisandmineralizationinMC3T3-E1mouseosteoblasts,andtoelucidateitspossiblemolecularmechanismfromtheperspectiveofautophagy.Methods:MC3T3-E1cellswereculturedinvitroandirradiatedwithamedicallinearacceleratoratapulserateof