中药安迪注射剂对白血病k562细胞株增殖和凋亡的影响

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1、中药安迪注射剂对白血病K562细胞株增殖和凋亡的影响【关键词】安迪注射剂；白血病，幼红细胞，急性；细胞增殖；细胞凋亡　　中药具有十分重要的抗肿瘤作用，中药诱导肿瘤细胞凋亡也已成为近年来国内外研究的热点.王四旺等［1-2］研制的安迪(andiinjection，Adi)注射剂中的主要成分蟾酥，具有解毒、消肿、醒神、开窍、强心和止痛等作用，其化学成分含有蟾毒灵(bufalin，BL)，是蟾酥中的活性成分.田昕等［3］的研究表明,BL是一种有效的肿瘤细胞分化诱导剂，具有显著的抑制肿瘤生长的作用.本研究通过实验观察Adi对体外培养的人白血病K562细胞株增殖和凋亡的影响，为寻找到新的更有效的

2、抗肿瘤药提供依据.　　1材料和方法　　1.1材料　　Adi（生产批号：20060901，由第四军医大学药物研究所提供），实验前用生理盐水溶解，0.22μm滤膜过滤除菌后使其终浓度为1mg/mL，4℃保存，测pH值为7.2.二甲基亚砜，四甲基偶氮唑盐(MTT)（美国Sigma公司）；RPMI1640（GIBCO公司）；小牛血清（杭州四季青生物工程公司）；K562细胞株（第四军医大学实验动物中心提供）.　　1.2方法　　1.2.1细胞培养　　　将K562细胞悬浮培养在RPMI1640培养液中(含10ml/L加热灭活胎牛血清，1mmol/L谷氨酰胺，1mmol/L丙酮酸钠,青霉素、链霉

3、素各10×105U/L),培养条件为37℃，50mL/LCO2饱和湿度，培养基为含10ml/L小牛血清的RPMI1640，在37℃，50mL/LCO2条件下培养，1～2d传代1次，实验前24h半量换液，用锥虫蓝拒染法鉴定细胞活性在0.98以上.　　1.2.2MTT法检测　　K562细胞的活力采用文献［4］的方法检测细胞活力，实验时调整细胞数为1×105/mL，在培养板上接种处于对数生长期的K562细胞，每孔加细胞悬液200μL.Adi各处理组每孔加入Adi，终浓度分别为2.5，5.0，10.0，20.0，40.0，80.0和160.0μg/mL；对照组每孔加入等体积生理盐水，每组均

4、设3个复孔.将培养板放至37℃，50mL/LCO2温箱培养36h，加入MTT20μL溶液，继续培养4h后，离心，弃上清，加入二甲基亚砜150μL，微型混合器振荡，使结晶完全溶解，酶联检测仪在波长490nm处测定每孔的吸光度(A)值.实验重复3次.　　1.2.3检测细胞凋亡率　　K562细胞经10.0，20.0μg/mLAdi处理并培养36h，收集细胞(每组至少5×105个细胞)，参照文献［5］的方法采用AnnexinVFITC及PI染色后上机操作，以未染色细胞将机器调零，以AnnexinVFITC单染管和PI单染管作基准参照，选取散点图作直观显示.　　1.2.4K562细胞的形态

5、学观察　　5.0μg/mLAdi处理组和对照组K562细胞培养36h后,1000r/min离心10min，收集细胞.用无血清培养液洗涤后再次1000r/min离心10min，沉淀用2.5mL/L戊二醛固定2h，1mL/L锇酸固定1.5h，乙醇梯度脱水，Epon812树脂包埋，超薄切片机切片，醋酸铀和柠檬酸铅双重染色，JEM2000EX透射电镜下观察.　　统计学处理：采用SPSS13.0软件进行统计学分析，数据以x±s表示，统计学推断采用单因素方差分析，多重比较采用LSDt检验,P<0.05为差异有统计学意义.　　2.2细胞凋亡率　　K562细胞给药36h流式细胞仪分析结果表

6、明，细胞呈现出明显亚二倍体凋亡峰，且细胞凋亡及凋亡后死亡数量随着给药量的增加而增加.K562细胞在对照组以及10.0μg/mL和20.0μg/mL不同浓度的Adi作用下，凋亡细胞所占比例分别为10%，50%和39%，死亡细胞所占比例分别为3%，44%和56%.　　2.3细胞形态学观察　　电镜下可见对照组K562细胞呈圆形或卵圆形，表面有少量微绒毛，细胞器丰富，可见少量脂滴，细胞核不规则，核膜皱折样凹陷，核内染色质丰富，以常染色质为主，核仁大而明显，核质比较大；而经Adi处理后的K562细胞表面微绒毛消失，细胞膜光滑，细胞质浓缩成块状，核染色质边集沿核膜边缘排列（图1）.　　3讨论　　

7、BL是从传统中药蟾酥中提取的蟾毒配基之一，研究表明BL对人红细胞膜Na+2K+2ATP酶有强烈抑制作用和显著的抑制肿瘤生长作用,能够促进荷瘤动物细胞免疫功能,与化疗药物环磷酰胺/丝裂霉素C等起协同作用,能升高白细胞,有放射防护功能［6］.BL是一种有效的分化诱导剂,用其处理三株于人的白血病细胞系，包括早幼粒白血病HL60细胞，成单核细胞白血病U937细胞和成髓细胞白血病ML1细胞,观察到诱导分化的效果,三株细胞均朝单核/巨噬细胞样细胞的方向分化.有研究显