和厚朴酚对白血病细胞株k562增殖与凋亡影响的研究

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1、r”I㈠．√_111I，√●■■●111目录中文摘要⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯OOO⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯1英文摘要⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯5英文缩写⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯9研究论文和厚朴酚对人白血病细胞株K562细胞增殖与凋亡影响的研究前言⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯10丹U舌“⋯⋯一⋯⋯⋯““一”⋯⋯⋯“一”“⋯⋯“⋯⋯⋯⋯⋯一．“。10材料与方法⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯_⋯11结果⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯17附图⋯⋯··⋯··⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯·

2、·⋯⋯·····⋯⋯⋯⋯⋯····⋯···19附表⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯ood⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯OGOOO⋯22讨论⋯⋯⋯···⋯···⋯⋯⋯⋯····⋯······⋯······⋯⋯⋯··⋯⋯⋯24结论⋯··⋯⋯··⋯···⋯⋯··⋯··⋯⋯⋯·······⋯·········⋯⋯⋯⋯27参考文献⋯⋯⋯⋯⋯⋯OOOI⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯28综述凋亡相关基因与白血病⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯30致调}····⋯···⋯⋯····⋯⋯⋯⋯··········⋯⋯⋯⋯⋯⋯·····⋯⋯⋯····36个人简历⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯

3、⋯⋯⋯⋯38中文摘要和厚朴酚对人白血病细胞株K562细胞增殖与凋亡影响的研究摘要目的：白血病细胞同其他肿瘤细胞一样，具有逃逸细胞周期调控、无限增殖的特点，诱导其凋亡是目前治疗白血病的主要方法之一。现代医学发现和厚朴酚除具有抗氧化、抗炎、抗焦虑、抗菌、抗血栓形成作用外，还具有抗肿瘤的作用。本课题旨在研究和厚朴酚对慢性粒细胞白血病急变期细胞株K562增殖、凋亡的影响。方法：1．体外培养K562白血病细胞株：采用含10％热灭活(56℃，30min)的小牛血清和青霉素(100U／m1)、链霉素(100mg／m1)的RPMI1640培养基，在37℃、含5％C0

4、2、饱和湿度下培养，3—4天换液传代一次。取对数生长期的细胞用于实验。2．提取、培养健康人外周血单个核细胞：分别取3位健康成人供血者的血液各50ml，按血液：淋巴细胞分离液3：1的比例把血标本缓慢加入已装有淋巴细胞分离液的离心管中，整个操作过程始终保持在冰浴中进行。以20009／min离心10min，收取单个核细胞层，洗涤3次后，以RPMI1640培养液重悬细胞后常规培养。3．MTT法检测药物对K562细胞和健康人外周血单个核细胞的增殖抑制作用：取对数生长期K562细胞或健康人外周血单个核细胞，以5×104个细胞／孔的密度接种于96孔板中培养。实验组

5、设立8个药物浓度组，每组HNK的终浓度为5、10、15、20、25、30、35、40pg／ml，每个药物浓度组设8个复孔。对照组加入同样浓度的二甲基亚砜(DMSO)，分别培养24小时和48小时，培养结束前4h每TL力Jl入201alMTT溶液(5mg／m1)，2500rpm离心20rnin，弃上清，加入200“1DMSO，振荡仪振荡10rain，充分溶角牮结晶物，酶标仪测490nm处

6、I及光度A值，计算增值抑制率。试验重复3次。4．透射IU镜观察K562钏胞的超il似a,I钔i．：J．构变化：调整K562细J也密度为lX100纠胞／ml，与终浓度为1

7、0)．tg／ml

8、，f勺HNK共培养l0h，．Jf设埘j照组。中文摘要之后分别收集细胞，1000rpm离心10min，PBS洗一遍，4％戊二醛幽定过夜，PBS沈3遍，l％锇酸固定1h，PBS充分清洗。梯度乙醇脱水，丙酮浸透、包埋、超薄切片，醋酸双氧铀一柠檬双染，HITACHI．1200ES型透射电镜观察细胞形态变化并拍照。5．用AnnexinV／Pl双染细胞后用FCM法检测K562细胞和健康人外周血单个核细胞凋亡率变化：K562细胞和PBMCs分别在含有终浓度为0、10、15、20pg／mlHNK的RPMIl640培养基中培养24和48小时。在各实验

9、终点，收集各组细胞，悬于bindingbuffer中，加入AnnexinV，避光室温反应15min，上机检测前加入PI。6．Capase一3活性检测：按每孔1×106个细胞密度将K562细胞接种于6孔板，终浓度为10pg／ml的HNK处理6、12和24小时后，每个样本收集约2×106个细胞，加入50I．tl预冷的celllysisbuffer重悬细胞，冰浴10min，离心lOOOOedmin，转移上清至新的Eppendorf管，置于冰上。测蛋白浓度后，加入相应celllysisbuffer稀释蛋白至相同浓度，加30入501xl反应液及51．tl4mM

10、DEVD．pNA，37℃孵育1小时后加入96孔板测OD405值，与对照组比较，计算增加倍数。7．检测线粒体P