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时间:2018-11-01
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1、中药安迪注射剂对白血病K562细胞株增殖和凋亡的【摘要】目的:探讨安迪(Adi)注射剂对人白血病K562细胞株增殖和凋亡的影响.方法:MTT法测定K562在Adi作用后的细胞活力(A值);流式细胞技术检测细胞凋亡变化;电镜观察细胞的形态学改变等;综合评价Adi对K562细胞株增殖和凋亡的影响.结果:①MTT法测得Adi在(2.5~20.0)μg/mL浓度范围内能明显抑制K562细胞的增殖,并具有浓度依赖性,20.0μg/mLAdi作用36h的K562细胞株A值最低;②流式细胞仪检测结果显示10.0,20.0μg/mLAdi处理组K562细胞的凋亡率分别为5
2、0%和39%,明显高于对照组的10%(P<0.05);③电镜下可见K562细胞呈典型凋亡样改变.结论:Adi能明显抑制K562细胞增殖,并具有显著促进细胞凋亡的作用.【关键词】安迪注射剂;白血病,幼红细胞,急性;细胞增殖;细胞凋亡 中药具有十分重要的抗肿瘤作用,中药诱导肿瘤细胞凋亡也已成为近年来国内外研究的热点.王四旺等[1-2]研制的安迪(andiinjection,Adi)注射剂中的主要成分蟾酥,具有解毒、消肿、醒神、开窍、强心和止痛等作用,其化学成分含有蟾毒灵(bufalin,BL),是蟾酥中的活性成分.田昕等[3]的研究表明,BL是一种有效
3、的肿瘤细胞分化诱导剂,具有显著的抑制肿瘤生长的作用.本研究通过实验观察Adi对体外培养的人白血病K562细胞株增殖和凋亡的影响,为寻找到新的更有效的抗肿瘤药提供依据. 1材料和方法 1.1材料 Adi(生产批号:20060901,由第四军医大学药物研究所提供),实验前用生理盐水溶解,0.22μm滤膜过滤除菌后使其终浓度为1mg/mL,4℃保存,测pH值为7.2.二甲基亚砜,四甲基偶氮唑盐(MTT)(美国Sigma公司);RPMI1640(GIBCO公司);小牛血清(杭州四季青生物工程公司);K562细胞株(第四军医大学实验动物中心提供). 1.2
4、方法 1.2.1细胞培养 将K562细胞悬浮培养在RPMI1640培养液中(含10ml/L加热灭活胎牛血清,1mmol/L谷氨酰胺,1mmol/L丙酮酸钠,青霉素、链霉素各10×105U/L),培养条件为37℃,50mL/LCO2饱和湿度,培养基为含10ml/L小牛血清的RPMI1640,在37℃,50mL/LCO2条件下培养,1~2d传代1次,实验前24h半量换液,用锥虫蓝拒染法鉴定细胞活性在0.98以上. 1.2.2MTT法检测 K562细胞的活力采用文献[4]的方法检测细胞活力,实验时调整细胞数为1×105/mL,在培养板上接种处于对数
5、生长期的K562细胞,每孔加细胞悬液200μL.Adi各处理组每孔加入Adi,终浓度分别为2.5,5.0,10.0,20.0,40.0,80.0和160.0μg/mL;对照组每孔加入等体积生理盐水,每组均设3个复孔.将培养板放至37℃,50mL/LCO2温箱培养36h,加入MTT20μL溶液,继续培养4h后,离心,弃上清,加入二甲基亚砜150μL,微型混合器振荡,使结晶完全溶解,酶联检测仪在波长490nm处测定每孔的吸光度(A)值.实验重复3次. 1.2.3检测细胞凋亡率 K562细胞经10.0,20.0μg/mLAdi处理并培养36h,收集细胞(每组
6、至少5×105个细胞),参照文献[5]的方法采用AnnexinVFITC及PI染色后上机操作,以未染色细胞将机器调零,以AnnexinVFITC单染管和PI单染管作基准参照,选取散点图作直观显示. 1.2.4K562细胞的形态学观察 5.0μg/mLAdi处理组和对照组K562细胞培养36h后,1000r/min离心10min,收集细胞.用无血清培养液洗涤后再次1000r/min离心10min,沉淀用2.5mL/L戊二醛固定2h,1mL/L锇酸固定1.5h,乙醇梯度脱水,Epon812树脂包埋,超薄切片机切片,醋酸铀和柠檬酸铅双重染色,JEM20
7、00EX透射电镜下观察. 统计学处理:采用SPSS13.0软件进行统计学分析,数据以x±s表示,统计学推断采用单因素方差分析,多重比较采用LSDt检验,P<0.05为差异有统计学意义. 2结果 2.1MTT法检测 K562细胞活性随着Adi浓度的增高和作用时间的延长,K562细胞的存活数下降,在作用24h后细胞基本上存活,处理36h后细胞多数凋亡,但48h后不同剂量Adi处理组细胞基本都已死亡,提示Adi引起K562细胞凋亡最佳时间为36h.对照组的A值(0.629±0.016)与2.5μg/mLAdi处理组的A值(0.489±0.033)
8、的差异具有统计学意义(P<0.05),大于20.0μg/mL
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