瑞香狼毒水提取物对人肺鳞状细胞癌survivin表达的影响

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1、瑞香狼毒水提取物对人肺鳞状细胞癌Survivin表达的影响：邢立强，赵建清，李旺，孙黎【摘要】目的研究瑞香狼毒水提取物对人肺鳞状细胞癌NCI-H520细胞株的抑制作用及对Survivin表达的影响。方法用不同浓度的瑞香狼毒水提取物处理NCI-H520细胞，分别用MTT法检测肺癌细胞抑制率、半定量RT-PCR检测SurvivinmRNA水平以及用I1640培养基5ml，瓶盖微松，放置37℃，5%CO2及饱和湿度的细胞培养箱中，细胞培养至对数生长期。消化、计数，调整细胞浓度至5×104个/ml，将其接种至96孔培养板中。　　1.4MTT法检测

2、NCI-H520细胞抑制率将细胞接种至96孔板，每孔100μl;置CO2培养箱中继续培养24h后,于96孔板中依次加入不同浓度的瑞香狼毒水提取物(5，0.5，0.05g/ml)每一浓度设4个复孔，另设空白组和对照组。继续培养4，8，12，24h后每孔加入MTT试剂30μl混匀，置CO2培养箱中继续培养4h后弃上清，每孔加二甲基亚砜100μl，10min后用酶标仪在492nm发射波长下读数，计算细胞抑制率。抑制率的计算：抑制率=1-(OD处理组-OD空白组/OD对照组-OD空白组)。　　1.5逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)Trizol一

3、步法提取不同浓度瑞香狼毒水提取物作用不同时间的细胞总RNA，取1μg总RNA用RT-PCR试剂盒进行逆转录，PCR扩增Survivin，同时扩增β-actin作为内参。引物由大连宝生物工程公司合成，Survivin引物序列为F：5'-CCCTGCCTGGCAGCCCTTTC-3'R：5'-CTGGCTCCCAGCCTTCCA-3'所扩增片段为188bp。β-actin引物序列为F：5'-GGGAAATCGTGCGTGACATT-3'R：-CGGACTCGTCATACTCCTGCTTG-3'所扩增片断大小为512bp。产物经2%的琼脂糖凝胶

4、检测，紫外灯下观察并拍照。　　1.6TT法检测瑞香狼毒水提取物处理4，8，12，24h后的各组细胞毒性分析结果显示，瑞香狼毒对该细胞株有明显的生长抑制作用，浓度越高作用时间越长抑制作用越明显。　　2.2瑞香狼毒对NCI-H520细胞株SurvivinmRNA表达的影响将NCI-H520细胞株用不同浓度的瑞香狼毒处理4，8，12，24h后，按Trizol试剂盒说明提取总RNA，然后用反转录试剂盒把mRNA转录成cDNA，用Survivin和β-actin的引物对各样品的cDNA进行扩增，扩增完毕后用2%的琼脂糖凝胶电泳检测，结果表明Surv

5、ivin的表达在mRNA水平上无明显改变。　　3讨论　　瑞香狼毒作为中草药应用已有悠久历史，《中国药典》记载其性味苦、平、辛、有毒,入肝、肺、脾三经,有逐水、祛痰、破积、杀虫之功效[2]，并发现其具有明显的抗肿瘤作用。目前由于恶性肿瘤化疗中常用化疗药物的剧烈毒副作用和获得性耐药的出现，严重影响了化疗效果。近年来，中药抗肿瘤逐渐引起人们的重视。国内外学者对瑞香狼毒的抗肿瘤作用进行了大量研究。如对肝癌、肺癌、食管癌、宫颈癌、肉瘤、白血病细胞等[3～5]恶性肿瘤方面影响的研究均有涉足。现有研究多侧重于瑞香狼毒提取物对不同类型肿瘤细胞的抑制率和瑞

6、香狼毒抗肿瘤成分等方面。对瑞香狼毒水提取物抗肿瘤机理的研究较少。　　Survivin是新发现的凋亡抑制蛋白家族(inhibitorofapoptosisproteinfamily,IAPfamily)中的新成员，与细胞分裂、增殖等功能密切相关。Survivin在胚胎组织和大多数肿瘤组织中高表达，而在正常的终末分化组织和癌旁组织沉默[6]，提示此蛋白可能与肿瘤的发生有密切关系。Survivin的过表达几乎出现在所有早期非小细胞肺癌病人，因此,Survivin的过表达可作为肺癌早期诊断的一个参考性指标，具有早期诊断价值[7]。Survivin

7、的表达状况与患者的年龄、性别、病理组织学之间无关，而与分期有关，分期越晚其阳性率越高[8]，又可作为判断肺癌病人预后的指标[9]。研究还表明，单独封闭Survivin基因可充分介导细胞凋亡，具有较好的靶向特异性，有望成为抗肿瘤治疗的一个新途径。　　非小细胞肺癌包括腺癌、鳞状细胞癌、大细胞未分化癌等类型，约占肺癌患者总数的80%。本研究选择人肺鳞状细胞癌NCI-H520细胞株，探讨给予瑞香狼毒处理后细胞的生长抑制及凋亡抑制蛋白Survivin的表达及其mRNA转录水平。结果显示：瑞香狼毒水提取物对NCI-H520细胞株具有明显的抑制作用。这

8、与我们以往的研究结果一致[10]，也为许多学者的研究所证实。研究结果还发现瑞香狼毒水提取物对Survivin的表达具有明显抑制作用，并具有浓度和时间依赖性。而SurvivinmRNA的转录水平