羧基荧光素乙酰乙酸对大鼠骨髓间质干细胞体外染色的

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1、羧基荧光素乙酰乙酸对大鼠骨髓间质干细胞体外染色的【摘要】　　目的探讨活体染料羧基荧光素乙酰乙酸（CFSE）标记大鼠骨髓间质干细胞（MSCs）的可行性和最适条件。方法清洁型SD大鼠20只，用密度梯度离心结合贴壁法分离、纯化、培养大鼠MSCs，取长满25cm×25cm培养瓶瓶底的第3代大鼠MSCs，用2.5，5，10，20，40μmol/L的CFSE分别作用1，5，10，15，20min后染色，通过观察染色后细胞荧光强度和细胞贴壁率筛选出CFSE标记大鼠MSCs的最佳标记时间和标记浓度。采用MTT法检测最佳条件CFSE标记的大鼠MSCs的增殖能力。结果浓度10μmol/L的CFSE在37

2、℃下孵育10min为MSCs染色、观察和研究的最佳条件。此条件下，CFSE标记的MSCs的增殖能力不受影响。结论活体染料CFSE是一种标记率高、细胞毒性小、操作简便的标记大鼠MSCs的新方法，浓度10μmol/L的CFSE在37℃下孵育10min为CFSE标记大鼠MSCs的最佳条件。【关键词】荧光素；乙酰乙酸盐类；骨髓细胞；间质干细胞；染色与标记；大鼠　　骨髓间质干细胞（mesenchymalstemcells,MSCs）是骨髓内的非造血干细胞，具有广泛、取材容易、在体外长期培养过程中始终保持其多向分化潜能、体内移植反应弱、克服了有关伦理学及免疫排斥问题等优点，是组织工程和细胞移植治

3、疗的最佳种子细胞[12]。为研究MSCs的移植疗效，需对MSCs在体内的存活、迁移、分布及增殖、分化进行监测，因此需要有效的标记方法区别供体细胞和受体细胞。已有的标记物如放射性探针、荧光素探针和绿色荧光蛋白等用于MSCs标记，但在应用过程中也存在诸多问题。活体染料羧基荧光素乙酰乙酸（5，6，2－carboxyfluoresceindiacetatesuccinimidyester，CFSE）是一种可穿过细胞膜、自动而且不可逆地与胞内蛋白和膜表面蛋白结合的荧光染料，近年来在神经科学和免疫学已有广泛应用[3]。但CFSE对不同细胞体外染色的标记时间和标记浓度不同[4]。为探讨CFSE标

4、记大鼠MSCs的最佳标记时间和标记浓度，笔者应用CFSE对体外培养的大鼠MSCs染色进行系统研究，报告如下。　　1材料与方法　　1.1材料　　1.1.1实验动物选用清洁级健康雄性SD大鼠20只，2～3月龄，体质量150～250g[福建医科大学实验动物中心提供，合格证号SCXK(闽2004－0008)]。　　1.1.2主要试剂和仪器DMEM培养基、胎牛血清FBS（美国HyClone公司）；胰蛋白酶（Trypsin1∶250，Amersco）；PBS、FicollPaque分离液（美国Pharmacia公司）；染料CFSE（美国Sigma公司）；荧光标记小鼠抗大鼠单克隆抗体CD34P

5、E、CD45FITC、CD29FITC、CD90FITC(美国PharMingen公司)；ThermoFormaCO2孵育箱（3111，USA），BeckmancounterEpicsXL流式细胞仪（美国BD公司），倒置相差显微镜（IX70，德国OLYMPUS公司），倒置相差荧光显微镜（CoiCB5203，德国OLYMPUS公司），激光共聚焦显微镜(德国Leica公司)。　　1.2方法　　1.2.1MSCs的培养、传代与鉴定大鼠氯胺酮（60mg/kg）腹腔注射麻醉，浓碘伏消毒。取双侧四肢骨，剪除干骺端，暴露骨髓腔，用10mL培养液（含10000U肝素）冲洗骨髓腔。将所获骨髓缓慢

6、加入已含FicollPaque分离液3mL的试管内梯度离心（2000r/min，30min），吸取富含粒细胞中间界面层，PBS洗涤3次，制成单细胞悬液接种。培养条件为37℃、饱和湿度、体积分数为0.05的CO2，培养液为DMEM（含有10%FBS，100U/mL青霉素，100mg/mL链霉素）。每3～4d更换1次培养液，去除未贴壁细胞，至细胞融合时胰酶消化收集细胞，传代并检测CD34、CD45、CD29、CD90。　　1.2.2CFSE染色及最佳条件筛选2.5mgCFSE用500μL二甲基亚枫（DMSO）溶解，制成10mmol/L的储存液，放于－20℃冰箱内保存。临用前取适量，用M

7、SCs培养基分别稀释成2.5，5，10，20，40μmol/L的不同浓度。取长满25cm×25cm培养瓶瓶底的第3代大鼠MSCs26瓶，其中1瓶做等量空白对照，其余25瓶分5组，每组5瓶，分别加入含不同浓度CFSE的MSCs培养基5mL，置37℃培养箱分别孵育1，5，10，15，20min。用PBS漂洗3次，490nm激发波长荧光显微镜下观察CFSE标记情况。标记率为：　　标记率＝暗视野所见发绿色荧光的细胞数/明视野所见的细胞数×100％　　530nm发射