oct34在体外诱导大鼠骨髓间质干细胞神经分化中的作用

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1、郑州大学硕士学位论文Oct3/4在体外诱导大鼠骨髓间质干细胞神经分化中的作用姓名：王舒阳申请学位级别：硕士专业：神经病学指导教师：贾延劼；王景涛201204摘要0ct3／4在体外诱导大鼠骨髓间质干细胞神经分化中的作用研究生王舒阳导师贾延劫教授王景涛博士郑州大学第一附属神经内科中国郑州450052摘要背景与目的骨髓间质干细胞(marrowmesenchymalstemcells。MSCs)是一类来源于成熟骨髓、脐带血及脂肪组织等多种组织分离出来，具有多向分化潜能干细胞。MSCs具有很强的自我增殖、多向分化能力，在特定的条件下可以向不同的细胞进行分化，既可以向中胚层组织分化如骨细胞、心肌细胞等

2、，又可以向外胚层组织分化如神经细胞等。MSCs具有来源方便、增殖能力强大、多向分化潜能等优点，因此在临床主要应用于血液系统疾病，心血管疾病，以及神经系统疾病的诊断与治疗。尤其是在神经系统疾病方面，MSCs的发现为神经系统变性病、中枢神经损伤等患者提供了新的治疗方法，具有长远的发展前景。诱导MSCs向神经细胞分化是一种横向的分化方式，存在着分化效率低、分化调节机制不明确等缺点，因此需要进一步研究。0ct3／4是POU域家族转录因子中的一员，主要表达于胚胎干细胞及生殖细胞中，是胚胎干细胞多潜能性的维持因子和生殖系细胞的调控因子，是目前已知的与胚胎发育全能性相关的重要转录因子，是哺乳动物体内全能

3、性胚胎干细胞的标志物之一。近年来有研究证明指出0ct3／4对细胞分化的控制是剂量依赖性的，其mRNA转录水平，或者说蛋白表达水平的不同可能是维持细胞不同的分化状态的主要因素，并且在诱导胚胎干细胞向神经细胞分化过程中，0ct3／4表达水摘要平总是对应相应的神经发生能力，当Oct3／4被连续传代减低，神经发生能力就受损。那么003／4是否在MSCs向神经细胞分化过程中起作用尚不清楚。因此，本研究采用慢病毒载体技术。构建003／4慢病毒载体，将其感染至大鼠MSCs中，深入探讨003／4在体外诱导MSCs分化为神经细胞中的作用。材料和方法选取Wistar大鼠为实验对象，雌雄不限，6,-一8周龄，分

4、离、传代培养MSCs，选取10代以上细胞进行实验。构建大鼠003／4慢病毒载体(Oct3／4一LV)并感染大鼠MSCs；实验分为感染组(感染Oct3／4．Lv)、阴性对照组(感染FU．PGC．NC．LV)、未感染组3组；采用B一巯基乙醇诱导各组大鼠MSCs分化为神经细胞。倒置荧光显微镜下观察MSCs感染后形态学变化；MTr法检测细胞存活率；免疫细胞化学法检测神经元烯醇化酶(NSE)、神经微管结合蛋白(MAP．2)、胶质纤维酸性蛋白(GFAP)和003／4的表达变化；Westernblotting法检测MAP．2、Oct3／4蛋白的表达变化；RT-PCR法检测MAP．2mRNA、003／4m

5、RNA的表达变化。复士旦=日木1．阳性克隆PCR证明大鼠Oct3／4慢病毒载体构建成功，孔稀释法测定病毒滴度为2x108m。2．倒置显微镜下观察大鼠003／4慢病毒载体感染成功，MO!值为10，感染48h时感染率最高，荧光表达最强；感染率可达83．4％±2．2％。感染组中，MSCs形态发生变化；MTlr提示感染组细胞存活率显著降低(P<0．05)。3．p一巯基乙醇可以诱导大鼠MSC．s向神经细胞分化，其中以感染组诱导效果最佳，具有比较典型的神经细胞形态，NSE和MAP．2的表达率与其它各组相比显著增高泸<0．05)。4．感染组与其它各组同时点的Oct3／4表达相比均显著增高(P

6、。并且随着诱导时间的延长，各组003／4表达持续减少，诱导后5h与诱导前相比存在显著差异(P<0．05)。结论Ⅱ摘要1．0ct3／4在MSCs向神经细胞诱导分化过程中，表达量随着诱导分化的进行减少：2．本研究成功构建了0ct3／4慢病毒载体，有效的增强了大鼠MSCs中0ct3／4的表达，促使MSCs向神经细胞分化效率提高，提示0ct3／4在大鼠MSCs诱导分化为神经细胞过程中可能起到了重要的调控作用。关键词：0ct3／4；骨髓问质干细胞；神经细胞；慢病毒AbstractConstructionoflentiviraIvectorOct3／4andtheroleofitindifferent

7、iationofratbonemarrowmesenchymaistemcellsintoneuronsPostgraduateWangShuyangTutorJiaYanjieWangjingtaoDepartmentofNeurology，TheFirstAffiliatedHospitalofZhengzhouUniversityZhengzhou，China,450052Background＆ObjectiveM