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时间:2018-11-05
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1、血管抑素对糖尿病肾病大鼠MMP2和MMP9表【摘要】 目的探讨腺相关病毒介导血管抑素基因(rAAVAS)对糖尿病肾病(DN)大鼠肾皮质中基质金属蛋白酶2(MMP2)和9(MMP9)表达的影响。方法采用链脲佐菌素(STZ)腹腔注射法建立糖尿病动物模型。SD大鼠随机分为对照组、糖尿病组、rAAV空载体组和rAAVAS治疗组。第10周检测大鼠的微量白蛋白尿(MAU)及肾脏肥大指数、肾功能、血糖、糖化血红蛋白;免疫组化观察肾皮质内MMP2、MMP9,光镜观察病理变化。结果治疗组肾皮质中MMP2、MMP9的表达高于糖尿病组,但都低于对照组,
2、免疫组化有相应的改变。结论rAAVAS对DN大鼠肾脏具有保护作用,其可能机制与其上调大鼠肾皮质中MMP2、MMP9的表达,从而减少肾组织细胞外基质(ECM)的聚集有关。【关键词】腺相关病毒介导血管抑素基因;糖尿病肾病;基质金属蛋白酶2;基质金属蛋白酶9 糖尿病肾病(DN)本质上就是一种血管内皮紊乱综合征,是糖尿病最常见的慢性微血管并发症之一。肾小球细胞外基质的聚集继而硬化是DN特征性的病理改变〔1〕。肾组织中促使ECM降解的主要生理调节子是基质金属蛋白酶(MMPs),即MMP2、MMP9,它可以降解已知的所有基质成分〔2,3〕。血管抑制素(
3、AS)能够特异性抑制肿瘤血管内皮细胞增生的因子〔4〕,增加MMP表达,降低DN的蛋白尿〔5〕,发挥肾保护作用。腺相关病毒介导血管抑素基因(rAAVAS)由于其宿主范围广,免疫原性低,表达携带基因长久等,被广泛用于基因治疗的实验研究〔6,7〕。本实验旨在探讨rAAVAS对DN大鼠肾皮质中MMP2、MMP9表达的影响及其可能作用机制。 1材料与方法 1.1材料 雄性SD大鼠,体重160~180g,8周龄,由徐州医学院动物中心提供。免疫组化试剂购于武汉博士德,链脲佐菌素(STZ)购自美国Sigma公司,rAAVAS由本元正阳公司构建。 1.2方
4、法 1.2.1实验分组和模型制备 实验动物随机分为对照组(NC组,n=10);糖尿病肾病组(DN组,n=15);腺相关病毒空载体组(rAAV0组,n=15),AS组(rAAVAS,n=15,2×1012μg/kg),STZ60mg/kg)腹腔注射诱导糖尿病模型,72h后尾静脉测血糖>16.7mmol/L,诊断为糖尿病,并持续1l经腹主动脉灌注双肾,取肾,去肾包膜滤纸吸干血迹,称肾重(KAU采用放射免疫法检测,HbA1c采用高压液相色谱法检测,BG由罗氏血糖仪及试纸检测,UCr、SCr由OLYMPUSAU2700全自动生化分析仪检测,并计算内生
5、肌酐清除率(Ccr),结果用大鼠体重校正。 1.2.4肾组织病理学观察 肾组织经10%中性甲醛固定,常规石蜡包埋,切片厚4μm,HE染色,光镜下观察肾组织形态学改变。 1.2.5免疫组化 采用二步法。4μm厚石蜡切片常规脱蜡至水,微波加热修复,3%H2O2阻断内源性过氧化物酶后,分别滴加兔抗大鼠MMP2(1∶50)、MMP9(1∶50)多克隆抗体,4℃过夜。37℃复温后滴加二抗,37℃孵育30min,DAB显色、苏木素复染、脱水、透明、封片。每张切片在高倍镜下(×200)随机采集10个视野,采用ImageProPlus6.0图像分析软件测定每
6、个视野中免疫组化阳性表达的积分光密度值(IOD),然后计算平均值。 1.3统计学处理 实验数据以x±s表示,采用SPSS13.0统计软件,组间比较采用单因素方差分析。 2结果 2.1动物一般情况观察 NC组大鼠毛发光泽,饮食正常,垫料5d换一次;DN组及rAAV0组毛发枯黄,明显消瘦、多尿、多饮、早期多动,后期反应迟钝、动作迟慢、多汗、毛竖无光泽、小便量多,垫料1~2d换一次;AS组饮食较DN组及rAAV0组明显改善,但不如正常组大鼠。表1各组BAU、BG、HbA1c的影响 与NC组比较,DN组及rAAV0组BG、HbA1c、Cr、MAU
7、明显升高(P<0.05)。AS组Cr、MAU、BG、HbA1c较DN组及rAAV0组降低(P<0.05),但DN组与rAAV0组间BG、HbA1c无统计学意义(P>0.05),见表2。表2各组BUN、Cr、24hMAU、BG、HbA1c的变化(略) 2.4免疫组化结果 NC组中MMP2、MMP9在肾小球及肾小管中均有微量表达,DN组及rAAV0组的表达则明显减弱(P<0.05),且主要在肾小管上皮细胞,而AS组的表达较DN组及rAAV0组增强(P<0.05),见表3,图1。表3各组肾组织MMP2、MMP9I
8、OD的比较(略) 3讨论本实验结果表明,在DN大鼠中,MMP2、
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