威灵仙皂苷化合物作为佐剂的研究

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1、K灵仙皂苷化合物作为佐剂的研宄中文摘要中药威灵仙来源：毛茛科植物威灵仙(ClematischinensisOsbeck)、东北铁线莲(ClematismanshuricaRupr.)和棉团铁线莲(ClematishexapetalaPall.)的干燥根及根莖。其性温，味辛、咸。有祛风湿、通经络、消骨哽、止痛之功效。秋季采挖，除去泥沙，晒干。主要用于风湿痹痛和诸骨哽咽，为治风湿痹痛之要药。木课题应用现代色谱分离技术从中药威灵仙中分离出8个结构新颖的皂苷，并以免疫活性为异向，对其溶血性与免疫佐剂活性做了评价。通过检测这8个皂苷的溶血性及对

2、模式抗原卵清蛋白(OVA)的佐剂活性，筛选出Compoundl(Cp1)和Compound2(Cp2)两个化合物，并探讨了两者作为佐剂的急性毒性以及肝功能损伤；评价了两者的溶血性和免疫佐剂活性；研究了两者作为佐剂时抗体在体内的时效应答作用；以及检测了两者引起的体内Thl/Th2的平衡问题。1.皂苷化合物的纯度检查、活性筛选与安全评价首先，采用HPLC检查了Cpl〜Cp8的纯度，都在97%以上，符合后续实验的需耍。然后采用比色法测定8个皂苷类化台物对0.5%兔红细胞的溶血性，以引起红细胞50%溶血浓度(HD50值)为标准，结果发现8个皂

3、苷溶血率均显著低予阳性药南美皂树皮皂苗(QuilA)(P<0.05)o采用ELISA方法检测了OVA模型小鼠血清中OVA特异性IgG抗体的免疫应答，筛选出Cpl和Cp2两个候选化合物。最后对两个化合物进行了急性毒理和肝功能损伤的安全评价，并在安全范围内研究了其佐剂活性和机理。2.皂苷的佐剂活性及其机理探讨采用ELISA方法检测了以OVA模型抗原的小鼠血清中OVA特异性IgG抗体及其亚型的免疫应答的情况。与OVA对照组相比，Cpl、Cp2均能显著的提高OVA免疫小鼠血清中特异性IgG抗体及其抗体亚型的效价Cpl(50ug)组和Cp2(2

4、5ug)组的佐剂活性显著或极显著的优于铝胶(Alum)组(P<0.05,P<0.01或P<0.001),尤其是对IgG2a和IgG2b的影响，显示出很好的促进OVA免疫小鼠Thl型免疫应答。但与完全弗氏佐剂组和QuilA组比较，无明显优势。MTT法检测了Cpl和Cp2对OVA受免小鼠脾淋巴细胞增殖反应的影响。结果表明：2个皂苷均能促进刀豆蛋白A(ConA)、脂多糖(LPS)和OVA诱导的OVA受免小鼠淋巴细胞增殖反应(P<0.05,P<0.01或P<0.001),其中Cpl(50Pg)组和Cp2(25Pg)组的佐剂活性最显著.采用流成

5、细胞仪CBA(CytometricBeadArray)技术检测丫Cpl、Cp2对免疫小鼠血清屮Thl/Th2类细胞因子含量，结果显示CpkCp2对肿瘤坏死因子(TNFa)、丫-干扰素(IFN-丫)、白介素-2(IL-2)、白介素-4(IL-4)和白介素-5(IL-5)的影响，相比OVA组均有显著性差异(P<0.05或P<0.01)o提示两者均对Thl和Th2型细胞因子有显著地促进作用。关键词：威灵仙、皂苷、佐剂活性、OVATHERESEARCHOFCLEMATISCHINENSISOSBECK^SSAPONINCOMPUNDASANA

6、DJUVANTPostgraduateZhouFengtaoSpecialityPharmacologySupervisorProfessorMaoshumeiABSTRACTRadixClematidisisoneofcommonusedtraditionalChinesemedicinefordispellingrheumatismandanalgesiaataclinic.ItsstipulatedsourcesarethedriedrootsandrhizomesofClematischinesisOsbeck，C.hexap

7、etalaPall.，CmandshuricaRupr.inChinesePharmacopoeia(2005).Withtheaimofselectingsaponinwithrelativelylowhaemolyticsaponinsandhighadjuvantactivitywhichmaybeusedasadjuvantinfuturelarge-scaledstudiesofvaccination.Eightsaponinswereisolatedandpurifiedfromthedriedrootsandrhizom

8、esofClematischinesisOsbeckusedbymodemchromatographicseparationtechniques.Afterhaemolyticactivitiesoftheisolate