人参皂苷Rg1与CpG DNA佐剂对细胞免疫功能的影响

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1、华东区第十七次中兽医科研协作与学术研讨会论文汇编人参皂苷Rgl与CpGDNA佐剂对细胞免疫功能的影响许小琴1李jt-Jtl韦旭斌妒(1、橱州太学2、古彝大学)摘要：为了探索人参皂苷R劫与菌体cpoDNA联合作为重组质粒peDNA-VP2基因疫苗免疫佐剂提高免疫效果的作用机理，采用鸡外周血淋巴细胞的体外诱导实验，通过细胞形态学观察、M兀测定法、流式细胞仪测定法和抗病毒性细胞病变抑制实验等，分别观察Rg．-CpG联合免疫佐剂对鸡外周血淋巴细胞的转化、增殖、活性及诱生干扰素效价的影响。结果显示：联合免疫佐荆按Rgl25峙+CpG12．5pg／mL的添加量．能使PHA诱导的

2、淋巴细胞转化率由74．3％显著增加到93．5％；细胞增殖率由4．88％显著增加到22．4％：抗VSV的干扰素效价由25显著增加到29。表明Rgl-CpG联合免疫佐剂具有明显促进鸡外周血淋巴细胞免疫功能的作用。关键词：人参皂苷R91；CpGDNA；免疫佐剂：细胞免疫人参皂苷Rgl与菌体CpGDNA联合作为重组质粒pcDNA-VP2基因疫苗的免疫佐剂，经动物免疫实验证实，既能提高基因疫苗免疫的血清抗体效价，又能提高免疫鸡抗超强毒攻击的保护率(另文报道)。现有的研究表明：人参皂苷R舶主要是促进血清中自蛋白、r．球蛋白、脾脏中蛋白质的合成，又通过促进巨噬细胞的吞噬能力、增加

3、抗原提呈，以提高抗原刺激机体产生抗体的效率”捌；cpoDNA是一种含胞嘧啶、鸟嘌呤二核苷酸(cpG)的DNA片段，主要是通过与细胞表面的一种核苷酸非特异性受体结合，直接激活B淋巴细胞、巨噬细胞和树突状细胞，诱导他们分泌儿．6、IL-12和TNF-d、IFN-r等细胞因子，从而激活整个免疫系统oⅣ】。为了探索二者联合应用提高重组质粒基因疫苗免疫效果的机理，本文采用鸡外周血淋巴细胞诱导实验，通过细胞形态学观察、MTT测定法、流式细胞仪测定法和抗病毒性细胞病变抑制实验等，分别观察Rgl、CpG和R91．CpG对鸡外周血淋巴细胞的转化、增殖、活性以及诱导淋巴细胞产生干扰素效

4、价的影响。1材料与方法1．1材料35日龄SPF自来航鸡、SPF鸡种蛋，均购自中牧实业股分有限公司南京药械厂SPF鸡繁殖场。水泡性口炎病毒(VSV)由南京农业大学陈溥言教授惠赠；禽源高致病性大肠杆菌(037株)，由扬州大学畜禽传染病农业部重点开放实验室分离鉴定。DMEM，RPMI1640为GibeoBRL公司产品；新生牛血清为杭州四季青公司产品。FITC标记的羊抗鼠IgG为Sigma公司产品；抗]BDV26E10单抗由美国禽病与肿瘤研究所患赠；鸡r干扰索由本室制备。人参皂苷Rg-为香港国际贸易有限公司天然有机化合物信息中&,(OELTA公司)产品；PHA为上海伊华医学

5、科技有限公司产品；淋巴细胞分离液为上海华精生物高科技有限公司产品；MTT为上海生物工程有限公司产品iDMSO为CxbioBioteehnology公司产品。PI(propidiumiodide，碘化丙啶)为Sigma公司产品。其它常规试剂均为国产分析纯级产品。1．2C扣GDNA制各常规方法培养禽大肠杆菌(037株)，按文献(6】方法提取菌体DNA，经一20℃和37"(2反复冻融5次后，于使用前煮沸10rain，然后冰浴中冷却30rain，制成2mg／mL溶液备用。109华东区第十七次中兽医科研协作与学术研讨会论文汇编1．3淋巴细胞转化实验1．3．1形态学观察无菌采取

6、35日龄SPF白来航鸡血液3ml，肝素钠抗凝，加等量的RPMI1640培养液，轻轻颠倒混匀，用淋巴细胞分离液，经水平离心机1500r／rain离心15rain，分离淋巴细胞，用含5％小牛血清的1640生长液配制成5×106／mL个淋巴细胞悬液，装瓶分组，每组重复5瓶。各组添加的药物及其浓度分别是；第1组为PHA50ug+Rgl25ug／mL；第2组为PHA50119+cpGl2．5ug／mL；第3组为PHA50pg+R9125Itg+CpGl2．5Itg／mL；第4组为PHA50ug／mL；第5组为仅加生长液的空白对照组。分别加入各种免疫佐剂药物后，于3TC、5％C

7、02培养箱中诱导培养，每天轻轻摇动2次。经72h培养后，1500r／min离心15min，分别收取各组淋巴细胞培养上清．于一20"C保存备用。将细胞沉淀物推片，瑞氏染色，每片观察200个淋巴细胞，每组重复5次，统计并计算淋巴细胞转化率。1．3．2流式细胞仪检测分离鸡外周血液淋巴细胞，用1640生长液调整细胞数为5X106／mL，按2Ⅱlu瓶，装瓶分组，按每mL淋巴细胞悬液分别加入试验药物：A组：PHA50Itg+Rgj25Itg；B组：PHA50itg+Rgl25ug+Cp912．5I-tg；C组：PHA50ug；D组：为仅加生长液的空白对照。于37℃5％C02