神经酰胺对结肠癌ht29细胞凋亡和增殖细胞核抗原表达的影响

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1、神经酰胺对结肠癌HT29细胞凋亡和增殖细胞核抗原表达的影响：严兴耘杨龙谭维国陈乐如许祥裕【摘要】目的探索神经酰胺（C2cer）影响人结肠癌HT29细胞增殖、凋亡和增殖细胞核抗原（PA）表达。方法12.5、25μmol/L的C2cer处理HT29细胞，用MTT法、流式细胞仪、激光共聚焦显微镜、SO）作溶剂；兔抗PA单克隆抗体和Cy3羊抗兔二抗，工作浓度为1∶150，Santan公司产品。免疫组化ABC试剂盒，北京中杉公司品。膜联蛋白荧光素(AnnexinVFLUOS)凋亡试剂盒，德国宝灵曼公司产品。　　1.2实验方法　　1.2.1实验分组低浓度组：12.5

2、μmol/L的C2cer处理HT29细胞，高浓度组：25μmol/L的C2cer处理HT29细胞，对照组：不含C2cer的DMSO处理组。　　1.2.2MTT检测96孔板中每孔加100μl的2×104/mlHT29细胞，预培养24h；每孔加100μl经二倍递减稀释的C2cer，再培养24h，每组平行3个复孔。加50g/LMTT试剂20μl，培养4h，弃上清160μl，加200μlDMSO，在MODEL450酶联仪(BIORAD)上测492、630nm双波长的OD值，绘制生长曲线。　　1.2.3细胞凋亡检测按试剂盒说明书进行。取约1×106细胞，PBS洗涤

3、后离心5min，弃尽上清，重悬于100μlAnnexinVFLUOS标记缓冲液(1000μl溶液Ⅲ中预先加入20μlAnnexinVFLUOS单抗及20μl50μg/mlPI)中，室温避光放10min，加0.4ml的溶液Ⅲ，上机检测。　　1.2.4免疫细胞化学检测PA表达将多聚赖氨酸包被过的无菌盖玻片置于培养瓶内，常规培养12h制作细胞爬片。取细胞爬片，4%多聚甲醛室温固定30min后用0.3%甲醇H2O2封闭非特异性15min，接着用含1%血清白蛋白(BSA)、0.5%苯基醚(TritonX100)的PBS缓冲液孵育打孔20min，然后用含5%羊血清的PBS

4、液孵育封闭20min，再加1∶150的PA抗体，室温2h后4℃过夜，最后经PBS冲洗后加1∶150的Cy3二抗且37℃孵育30min，20％甘油封片，德国产LeicaTCSNT型激光扫描共聚焦显微镜观察，测定细胞相对荧光强度。阴性对照实验：用PBS代替PA抗体孵育。　　1.2.5TT法观察C2cer影响HT29细胞增殖效应低于0.05μmol/L的C2cer对HT29细胞的增殖影响不明显(P＞0.05)，3.125～6.25μmol/L的C2cer明显减缓HT29细胞增殖，高于12.5μmol/L的C2cer细胞导致HT29增殖几乎完全停滞，细胞死亡。

5、见图1。　　图1C2cer影响HT29细胞增殖的抑制曲线（略）　　2.2AnnexinV/PI检测C2cer作用12h影响HT29细胞的凋亡AnnexinV结合PI染色，流式细胞仪把细胞分为坏死、凋亡晚期、正常和凋亡早期细胞。12.5、25.0μmol/L的C2cer作用HT29细胞12h后，细胞凋亡比例约为(53.64±9.11)%和(83.94±11.62)%，细胞凋亡呈剂量效应关系，表明C2cer是HT29细胞强有力的凋亡诱导剂。见表1。　　表1C2cer处理12h对HT29细胞凋亡的影响（略）　　与对照组比较：1）P＜0.01；与低浓度

6、组比较：2）P＜0.01　　图2免疫细胞化学检测HT29细胞PA表达(SP，×400)（略）　　2.4)，SM由鞘氨醇(SP)、脂肪酸及磷酸胆碱组成。C2cer是多种细胞功能如细胞分化、衰老、增殖和细胞循环停滞的第二信信使，激活酶级联反应和转录因子的转录活性，产生多种生物效应。许多胞外的刺激因素,如化疗药物、辐射、肿瘤坏死因子α和内毒素等引起的细胞凋亡均由C2cer将凋亡信号传递给其下游的靶分子,如激活SAPK/JNK等信号途径，引起凋亡的信号级联反应〔7〕。越来越多的研究表明，C2cer等鞘脂及其代谢物能够诱导多种肿瘤和恶性增殖细胞如腺癌、结肠癌、肝肿瘤、肺癌

7、、鼻咽癌等的凋亡。C2cer通过影响Bcl家族基因水平的表达和Fas、p53蛋白水平表达的改变，最终促进HT29结肠癌细胞凋亡〔2～4〕。本研究结果显示，细胞增殖受到抑制，细胞凋亡明显增加，并呈剂量效应关系。　　PA是一种与细胞周期相关的蛋白，在细胞核内合成，在G1期表达逐渐增加，S期达到高峰，G2/M期减少或消失，因此，PA作为细胞周期内S期的特异性标记，其出现与细胞增殖有关，其含量能反映细胞的增殖程度。PA是一种与DNA合成密切相关的细胞核内的酸性蛋白质，研究表明大肠癌中PA阳性表达率高于94.4%，与肿瘤预后较差相关〔6〕。本